Summary

No quirúrgico instilación intratraqueal de ratones con el análisis de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón por citometría de flujo

Published: May 02, 2011
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Summary

Nos ilustran no quirúrgico de entrega de materiales de prueba en los pulmones de ratones anestesiados a través de la tráquea. Este método permite la exposición del pulmón a los patógenos bacterianos y virales, las citocinas, los anticuerpos, los granos, productos químicos, ni colorantes. Nos describen con más detalle la recolección y procesamiento de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón (LDLNs) por citometría de flujo.

Abstract

Fagocitos como los macrófagos alveolares y las células dendríticas del pulmón (PMA) de forma continua muestra los antígenos de los espacios alveolares de los pulmones. Los países menos adelantados, en particular, se sabe que migran a los ganglios linfáticos pulmonares drenan (LDLNs) donde presentan antígenos inhalados a las células T de iniciar una respuesta inmune apropiada a una variedad de inmunógenos 1,2. A las interacciones del modelo entre los pulmones y los antígenos en el aire en los ratones, los antígenos se puede administrar por vía intranasal 1,3,4, intratraqueal 5 o 6 en forma de aerosoles. La entrega por cada ruta incluye distintas habilidades técnicas y las limitaciones que deben tenerse en cuenta antes de diseñar un experimento. Por ejemplo, la exposición intranasal en aerosol y ofrece tanto a los antígenos de los pulmones y el tracto respiratorio superior. Por lo tanto, los antígenos pueden acceder a la nasal de tejido linfoide asociado (NALT) 7, lo que podría complicar la interpretación de los resultados. Además, la deglución, el estornudo y la tasa de respiración del ratón también puede dar lugar a incoherencias en las dosis administradas. Aunque el compromiso del tracto respiratorio superior puede ser preferible para algunos estudios, puede complicar los experimentos se centra en los eventos específicamente iniciado en los pulmones. En este contexto, la intratraqueal (IT) es preferible, ya que proporciona los materiales de prueba directamente en los pulmones y pasa por el NALT. Muchos protocolos de inyección incluyen la intubación o ciegos de la tráquea a través de la cavidad oral o la exposición quirúrgica de la tráquea para acceder a los pulmones. En este documento, se describe un simple y consistente, método no quirúrgico para la instilación. La apertura de la tráquea se visualizan mediante un laringoscopio y una aguja doblada sonda se inserta directamente en la tráquea para entregar el inóculo. También se describen los procedimientos para la recolección y procesamiento de LDLNs y los pulmones para el análisis del tráfico de antígeno por citometría de flujo.

Protocol

1. Antes del proceso, preparar y reunir los siguientes Por favor refiérase a la imagen de la Figura 1a) y 1b) para la construcción de una plataforma de madera para contener el ratón durante el procedimiento. Digestión de la mezcla de los ganglios linfáticos – HBSS + 1.25mg/ml colagenasa TypeIV o 2,5 mg / ml de colagenasa D Mezcla de digestión para los pulmones – HBSS + 1 mg / ml de colagenasa Diluir las gotas de látex (1:20) en PBS durante la inyección intraperitoneal de …

Discussion

Hemos utilizado este protocolo para estudiar el tráfico de esporas de Bacillus anthracis de los pulmones a la LDLNs. Para aplicaciones similares, el número de partículas llega a los pulmones deben ser elegidos cuidadosamente para que el material inyectado puede ser detectado en el LDLNs por citometría de flujo. También se ha utilizado con éxito este método para la transferencia adoptiva de células y el etiquetado de poblaciones específicas de pulmón de células con anticuerpos marcados con fluorescenc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
70μm Cell stariner BD    
Aniline Blue Fisher A967-25  
Animal Feeding needle Popper and Sons Inc 7920  
Collagenase Sigma C2139  
Collagenase TypeIV Worthington    
Collagenase D Roche 11088974103  
DPBS Invitrogen 14190  
Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) Polysciences, Inc 17152  
HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride Invitrogen 14170  
Ketamine HCl  (100mg/ml) Hospira Inc    
Laryngoscope Blade PennCentury, Inc For Model LS-1 Refer to www.penncentury.com
Lightweight Fiber Optic Laryngoscope WelchAllyn 80814  
Red Fluorescent Beads (0.5μm) Invitrogen F8812 For i.p injection
Xylazine (100mg/ml) Lloyd Laboratories    

References

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Cite This Article
Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702, doi:10.3791/2702 (2011).

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