Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma
Summary
Biz anestezi farelerin trakea yoluyla ciğerlerine test malzemelerin cerrahi olmayan teslimat göstermektedir. Bu yöntem, bakteriyel ve viral patojenler, sitokinler, antikorlar, boncuk, kimyasallar, ya da boyalar akciğer maruz izin verir. Daha hasat ve flow sitometri akciğer ve akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) işlenmesi açıklanmaktadır.
Abstract
, Alveoler makrofaj ve akciğer dendritik hücreler (LDC) olarak fagositik hücrelerin sürekli olarak akciğerlerde alveoler boşluklar antijenleri örnek. En az gelişmiş ülkelere, özellikle de akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) T hücreleri başlatılması için uygun bir immün yanıt immünojenleri 1,2 çeşitli inhale antijenlere mevcut. Göç etmek bilinmektedir Farelerde akciğer ve havadaki antijenleri arasındaki etkileşimler modeli, antijenler intratrakeal 5 veya aerosoller 6 olarak, intranazal 1,3,4 idare edilebilir. Her güzergah tarafından teslim ayrı teknik beceri ve bir deney tasarımı önce dikkate alınması gereken kısıtlamalar içerir. Örneğin akciğerlerin ve üst solunum yolu, burun içi ve aerosol maruz antijenleri sağlar. Dolayısıyla antijenler potansiyel sonuçların yorumlanması komplike, burun ilişkili lenfoid doku (NALT) 7 erişebilirsiniz. Buna ek olarak, yutkunma, hapşırma ve farenin solunum oranı da teslim edilen dozlar tutarsızlıklara yol açabilir. Üst solunum yolu tutulumu bazı çalışmalar için tercih edilebilir olsa da, özellikle akciğerlerde başlatılan olaylara odaklanan deneyler karmaşık hale getirebilir. Bu ortamda, doğrudan ciğerlerine test materyalleri sunar ve NALT atlar intratrakeal () yol tercih edilir. Birçok bu enjeksiyon protokolleri oral kavite veya akciğerlere erişmek için trakea cerrahi maruz kalma yoluyla trakea ya kör entübasyon içerir. Burada, biz bu instilasyon için basit, tutarlı, cerrahi olmayan bir yöntem açıklanmaktadır. Trakeanın açılması bir laringoskop kullanılarak görüntülendi ve kıvrık bir sonda iğne sonra innoculum teslim trakea doğrudan eklenir. Ayrıca, hasat ve LDLNs ve akciğerler, flow sitometri ile antijen ticareti analiz için işlenmesi için prosedürler açıklanmaktadır.
Protocol
Discussion
Bacillus anthracis sporları akciğerlerden LDLNs ticareti incelemek için bu protokol kullanılmaktadır. Benzer uygulamalar için, akciğerlere teslim parçacıkların sayısını dikkatli bir şekilde enjekte edilen malzeme akış sitometri LDLNs tespit edilebilir, böylece seçilmiş olmalıdır. Biz de başarıyla hücreleri ve floresan etiketli antikorlar kullanarak belirli bir akciğer hücre popülasyonlarının etiketleme evlatlık transferi için bu yöntemi kullanmıştır. Ayrıca, bu yöntem rutin …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 70μm Cell stariner | BD | ||
| Aniline Blue | Fisher | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper and Sons Inc | 7920 | |
| Collagenase | Sigma | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington | ||
| Collagenase D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | WelchAllyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd Laboratories |
References
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer’s-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
