לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry
Summary
אנו מדגימים לא ניתוחי מסירה של חומרי הבדיקה לריאות של העכברים הרדים דרך קנה הנשימה. שיטה זו מאפשרת חשיפה הריאות לפתוגנים, ציטוקינים חיידקים ווירוסים, נוגדנים, חרוזים, כימיקלים, או צבעים. בנוסף, אנו מתארים קציר ועיבוד של הריאות ניקוז ריאה בלוטות לימפה (LDLNs) עבור cytometry הזרימה.
Abstract
תאים Phagocytic כגון מקרופאגים מכתשיים ריאות תאים דנדריטים ו (LDCs) ברציפות מדגם אנטיגנים מן החללים מכתשיים בריאות. LDCs, בפרט, ידועים להגר ריאה בלוטות הלימפה לנקז (LDLNs) שבו הם מציגים אנטיגנים לתאי T בשאיפה ליזום תגובה חיסונית מתאימה למגוון immunogens 1,2. כדי אינטראקציות בין מודל הריאות אנטיגנים הנישאים באוויר בעכברים, אנטיגנים יכול להינתן intranasally 1,3,4, intratracheally 5 או 6 אירוסולים. משלוח על ידי תוואי זה כרוך מיומנויות טכניות שונות ואת המגבלות שצריכות להיחשב לפני תכנון ניסוי. לדוגמה, חשיפה intranasal ו aerosolized מספק אנטיגנים הן הריאות בדרכי הנשימה העליונות. לפיכך אנטיגנים יכולים לגשת רקמות האף הקשורים הלימפה (NALT) 7, פוטנציאל סיבוך הפרשנות של התוצאות. בנוסף, בליעה, התעטשות לבין קצב הנשימה של העכבר עשויה גם להוביל הסתירות במינונים נמסר. למרות מעורבות של דרכי הנשימה העליונות עלול להיות המועדפת עבור מחקרים, זה יכול לסבך ניסויים התמקדות באירועים יזם במיוחד בריאות. בהגדרה זו, את המסלול intratracheal (זה) עדיף כפי שהוא מספק חומרים מבחן ישירות לתוך הריאות עוקף את NALT. פרוטוקולים רבים זה כרוך הזרקה אינטובציה עיוור או של קנה הנשימה דרך חלל הפה או חשיפה כירורגית של קנה הנשימה כדי לגשת הריאות. בזאת, אנו מתארים פשוטה, עקבית, לא ניתוחי שיטת החדרה זה. פתיחת קנה הנשימה הוא מדמיין באמצעות ראי גרון ומחט gavage כפוף מוכנס אז ישירות לתוך קנה הנשימה כדי לספק את innoculum. אנחנו גם לתאר נהלים קציר ועיבוד LDLNs והריאות לניתוח סחר אנטיגן על ידי cytometry הזרימה.
Protocol
Discussion
יש לנו שימוש בפרוטוקול זה ללמוד הסחר של נבגים anthracis Bacillus מהריאות אל LDLNs. עבור יישומים דומים, מספר חלקיקים נמסר לריאות יש לבחור בקפידה כך שהחומר המוזרק ניתן להבחין LDLNs על ידי cytometry הזרימה. יש לנו גם השתמשו בהצלחה בשיטה זו להעברת המאמצת של תאים וסימון של אוכלוסיות תא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 70μm Cell stariner | BD | ||
| Aniline Blue | Fisher | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper and Sons Inc | 7920 | |
| Collagenase | Sigma | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington | ||
| Collagenase D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | WelchAllyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd Laboratories |
References
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer’s-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
