In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Pendant le développement embryonnaire, le tissu et la morphogenèse d'organes ont lieu grâce à un programme précis qui peut être décrite en termes de prolifération cellulaire, la migration cellulaire et la spécification de la lignée 1-4. Ces processus biologiques sont également impliqués dans le maintien de l'homéostasie tissulaire adulte, qui nécessite endiguer la régénération cellulaire. Le traçage de Lineage, l'identification et le suivi de la descendance d'un type spécifique de la population de la cellule, fournit un outil important pour l'étude de l'embryogenèse et l'homéostasie des cellules souches. En effet, il est de plus en plus utilisé dans de nombreux domaines de la recherche. En particulier, la lignée traçage est devenu un outil essentiel dans identifier l'origine et le destin des cellules souches dans l'homéostasie et le développement du cancer. En effet, il peut fournir des informations sur la façon essentielle la cellule se comporte dans le cadre de l'organisme ou tissu intact, avec intervention minimale d'expérimentation, à la différence de l'isolement des cellules en culture et in vitro ou transplantatisur risquant d'entraîner polarisation indésirable.
Traditionnellement, les colorants tels que liposoluble carbocyanine, qui intègrent dans la membrane plasmique des cellules, ont été utilisées pour la lignée de traçage. Bien que ces types d'expériences ont conduit à des découvertes majeures avec succès et de concepts séminales façonnés dans la biologie du développement 5,6, ils présentent certaines limites, notamment la difficulté de contrôler la spécificité des cellules cibles, l'effet indésirable du colorant sur le comportement des cellules et la dilution de l'étiquette dans le temps. Nucléotidiques approches d'étiquetage analogique ont permis de documenter l'existence de slow-vélo "label conservant cellules" qui correspondent vraisemblablement à quiescent cellules souches 7,8. Toutefois, bien que cette technique pourrait démontrer la présence de cellules de cyclisme lente basé sur la cinétique de prolifération sur une période de temps limité, il ne pouvait pas fournir des indications importantes en ce qui concerne la fonctionnalité des cellules souches. Un optimale meth lignée de traçagedologie devrait minimiser l'effet de l'étiquetage sur les propriétés de la cellule marquée, ses descendants ou ses voisins. En outre, il serait bénéfique d'avoir le contrôle sur l'induction de l'étiquetage, à savoir, d'avoir la possibilité de marquer la population de cellules d'intérêt à un stade et d'une manière dépendant du temps ainsi que dans une seule cellule (clonale) manière. Procédé de marquage irréversible et stable qui est transmis à toute la descendance de la cellule fondateur est important de sorte que l'étiquette serait maintenue dans le temps, et pas transféré aux cellules voisines.
Plus récemment, des approches génétiques de marquage des cellules ont été développées. Dans ces systèmes, des promoteurs spécifiques de cellules peuvent être utilisés pour déclencher la recombinase Cre expression afin d'éliminer un barrage-loxP flanquée et permettre l'expression des gènes rapporteurs tels que la protéine fluorescente verte ou Β-galactosidase gènes rapporteurs 9-13. Cette approche permet non seulement le suivi des cellules et de leur progéniture, mais permet également de cellule estolation et caractérisation moléculaire. Suivi de cellule au niveau de la cellule unique est devenu possible grâce à l'induction de l'expression d'un seul gène rapporteur fluorescent. Une limitation importante de ce système est le fait que lorsque seulement une très faible pourcentage de cellules est marqué, il est possible de séparer et de tracer des clones individuels. Pour surmonter cette limitation reporters multicolores peuvent être utilisés. Lors de l'utilisation étiquetage multicolore, le suivi du sort différentielle des cellules voisines dans le même créneau peut être réalisé efficacement 14-17. Récemment, une variété de Brainbow (Br) allèles ont été développés pour les expériences de la lignée de traçage, ce qui permet une expression de multiples gènes stochastiques reporter fluorescentes en utilisant le / lox système Cre. Le système Cre / lox comprend la recombinase Cre enzyme, qui reconnaît et se lie à des séquences d'ADN spécifiques tels que des sites loxP. Après la liaison de la recombinase Cre, recombinaison site spécifique se produit, ce qui provoque l'élimination des séquences loxP flanquée resulting dans l'expression aléatoire des différentes protéines fluorescentes (le mécanisme est décrit ci-dessous). Une variété de lignes Br sont disponibles pour l'utilisation (voir les commentaires 16,18,19). Les principales différences entre les souches Br comprennent (i) des différences dans le nombre de gènes fluorescents inclus dans la cassette, allant de 2 (Br 2.0), 3 (Br1.0) à 4 (Br1.1, Br2.1) gènes fluorescents , (ii) la présence de sites lox réciproquement orientés pour permettre l'inversion de gène (Br2.0-2.1), (iii) le type de sites lox utilisées, et (iv) l'expression ou de silence de l'expression du gène fluorescent avant l'activation Cre. Le Br3 récemment établi propose un procédé amélioré de formation d'image multicolore des neurones. Une des principales caractéristiques de cette transcription est qu'il contient un nouvel ensemble de protéines photostables farnésylées fluorescentes, qui permettent à une coloration, même de la plus belle neuronal traite 20.
Surtout, les différentes versions de cassettes Br peuvent contenir spécifique neuronale Thy1 promoter ou exprimée de manière ubiquitaire CAG (CMV). Enfin, alors que certains des souris transgéniques Br peut contenir un seul transgène Br, d'autres peuvent consister en de multiples copies du transgène, ce qui permet la production d'un nombre immense de possibilités de combinaisons de couleurs pour être exprimé dans chaque cellule (voir par exemple 16).
Dans notre étude, nous avons utilisé la souris R26R-Confetti qui contient la cassette de 21 Br 2.1. Br2.1 est spécialement conçu pour permettre à des inversions de l'ADN Cre-médiation et non seulement des excisions en raison de l'orientation réciproque des sites loxP (Figure 1). Ainsi, ces événements inversion / excision qui conduisent à changement de couleur peuvent continuer aussi longtemps que Cre est présente 16. Pour cette raison, un système d'expression inductible Cre temporelle est essentielle pour le suivi cellulaire fiable à l'aide Br2.1. Comme le montre la Figure. 1, le Br2.1 contient un promoteur CAG omniprésente suivie par loxP flanquée Neo R -casseTTE, qui agit comme un barrage routier de la transcription, qui est suivie par 4 gènes rapporteurs fluorescents, l'encodage pour verte (GFP), jaune (YFP), rouge (RFP) et cyan (CFP) des protéines fluorescentes, positionnés dans deux tandems. Pas de fluorescence est exprimé avant l'activation Cre. L'induction de la recombinase Cre provoque le retrait de la cassette néo-R permettant l'expression statistique de l'une des protéines fluorescentes 4 dans une cellule donnée. Le premier segment contient GFP-loxP flanquée et une YFP inversée, tandis que le second segment contient DP-loxP flanquée et un PCP inversée. Ces segments d'ADN peuvent être inversés en continu (en utilisant loxP qui est en orientation inverse), ou excisés, aussi longtemps que la recombinase Cre est présente. Par conséquent, un transgène Cre transitoire et contrôlée doit être utilisé. La cassette Br2.1 fournit un excellent système pour distinguer entre les émissions se chevauchent sur l'emplacement de signal: l'expression de la YFP et RFP est cytoplasmique, la GFP est nucléaire et la PCP est lié à la membrane cellulaire. GFPet les émissions DP sont facilement séparés par microscopie à fluorescence conventionnelle. Afin de séparer les émissions YFP / GFP / PCP, un système d'imagerie confocale spectrale est nécessaire. Au total, la cassette Br2.1 permet l'expression spécifique aléatoire, inductible, et le tissu d'un sur quatre gènes fluorescents distincts dans chaque cellule ciblée. En fait, quand un plus grand nombre de combinaisons de couleurs est nécessaire, on peut générer des souris homozygotes contenant 2 allèles de Br2.1, conduisant ainsi à l'expression de 2 étiquettes de couleur pour chaque cellule et dans l'augmentation du nombre de combinaisons possibles de couleurs à 10 22. Certaines des souches de souris Br permettre l'expression d'un plus grand nombre de combinaisons possibles de couleurs depuis de multiples copies de la cassette ont été intégrées dans leur génome 16. Cependant, dans la plupart des cas, les quatre combinaisons de couleurs fournis par un seul allèle Br2.1 sont suffisantes. Après le protocole fourni ici, on peut établir cette méthode en utilisant une configuration relativement simple de spectral microscopie avec peu ou pas de nécessité d'un étalonnage.
Ici, nous fournissons un protocole adaptable pour l'utilisation de la souris R26R-confettis qui contiennent un seul allèle Br2.1, de la lignée de traçage expériences de l'épithélium cornéen. Cette souche de souris transgénique a été utilisé pour étudier l'origine et le devenir du côlon 21,23 et des cellules souches epitheliales cornéennes 22,24, la présence d'une activité de cellules souches dans le cancer intestinal 25, et pour la caractérisation de rein podocytes dans glomérulosclérose segmentaire et focale (FSGS) 17.
Expériences de la lignée de traçage ont été menées depuis de nombreuses années. Les améliorations technologiques récentes et l'émergence des souches de souris Confetti ont ouvert de nouvelles pistes de recherche. Aujourd'hui, les chercheurs peuvent bénéficier d'un grand nombre de lignes disponibles dans le commerce Cre tissu-spécifiques, souris knock-out et des souris transgéniques. Ceci constitue une opportunité pour la conception de systèmes expérimentaux polyvalente pour aborder les questions scientifiques ayant une expertise de base, en évitant la pratique laborieuse, tout en fournissant des données robustes et fiables.
Souris R26R-Confetti sont un outil élégant pour le suivi efficace et l'étude de la nature et le comportement des cellules dans un organisme vivant. Le système est facile à mettre en place et il permet le traçage lignée non-invasive de cellules isolées au cours de l'embryogenèse, la régénération des cellules souches sous l'homéostasie, ou dans des circonstances différentes, comme des blessures, l'inflammation et le cancer. Les données obtenue fournit une descript robusteion de la survie des cellules cibles, l'expansion clonale de cellules et la migration cellulaire, d'une manière quantifiable. Une étape cruciale serait de choisir la souche de souris génétique approprié qui peut sûrement permettre un étiquetage spécifique des tissus efficace à un stade de développement précis. Une limitation de ce système est que, pour la surveillance d'un organisme vivant, le tissu doit être accessible et transparent. De même, le suivi d'un épais tissu dans un animal vivant peut être que facilitée par deux photons ou la microscopie multi-photon. Toutefois, le suivi de la cellule est possible sur des coupes de tissus post-mortem et peut-être le tissu intact peut être étudiée après qu'elle a été transformée pour devenir transparent par le procédé de CLARTE 32,33. Une autre limite à prendre en compte est que, bien que les cellules adjacentes qui expriment le même fluorophore appartiennent vraisemblablement la même lignée clonale, il est également possible qu'ils peuvent être dérivés d'origine cellulaire indépendante qui exprime de façon aléatoire le même gène fluorescent. Cette PossiblesTy devient très peu probable lorsque vous utilisez plusieurs allèles Br pour permettre de nombreuses combinaisons de couleurs.
Dans le futur, combinant le système Confetti avec des outils génétiques disponibles (c.-à-KO, modèles knock et souris transgéniques) permettra l'étude des gènes et leurs mutations en matière de santé et de la pathologie. De même, la lignée de traçage sous différentes perturbations du système (c.-à enrayer la destruction de niche cellulaire, laser ablation à médiation cellulaire, traitement de la toxicomanie) va apporter de nouvelles idées sur l'implication des voies dans les décisions du destin de la signalisation cellulaire. En fin de compte, l'utilisation combinatoire de marquage fluorescent et bioluminescence, les journalistes génétiques des voies de signalisation et de coupe microscopie bord fournira aux chercheurs un système robuste d'apprendre comment les cellules seule répondre à leur environnement dans leur environnement natif.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |