In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
胚発生の間に、組織および器官の形態形成は、細胞増殖、細胞遊走および系統仕様1-4に関して説明することができる正確なプログラムを介して行われます。これらの生物学的プロセスは、細胞の再生幹必要成体組織の恒常性の維持に関与しています。リネージュトレース、細胞集団の特定のタイプの子孫の識別と追跡は、胚を研究し、細胞の恒常性幹ための重要なツールを提供します。実際、それは、ますます研究の多くの分野で使用されています。特に、系統のトレースは、恒常性と癌発生における幹細胞の起源と運命を特定するのに不可欠なツールとなりました。それは、細胞が細胞単離とは対照的に、かつインビトロ培養またはtransplantati に 、最小限の実験的介入で、無傷の組織または生物との関連でどのように動作するかについての基本的な情報を提供することができるためですその上で、不要なバイアスをもたらす可能性があります。
伝統的に、細胞の原形質膜に組み込むような脂溶性カルボシアニン染料としては、系統追跡のために使用しました。実験のこれらの種類が正常に発生生物学5,6に主要な発見や形状の精液概念につながっているが、それらは、標的細胞の特異性を制御する難しさ、細胞の挙動の色素の不要な影響や希釈などのいくつかの制限を持っていますラベルの時間。ヌクレオチドアナログラベリングアプローチは、おそらく幹細胞7,8を静止状態に対応する「ラベル保持細胞「スローサイクリングの存在を文書有効にしています。この技術は、限られた時間の期間にわたって増殖動態に基づいてスローサイクリング細胞の存在を実証することができながら、しかし、それは幹細胞の機能性に関する実質的な洞察を提供することができませんでした。最適な系譜トレースメタodologyはマークされた細胞、その子孫、またはその隣の性質上の標識の影響を最小限に抑える必要があります。加えて、ステージと、時間依存的な様式で、ならびに、単一の細胞(クローン)の方法で目的の細胞集団をタグ付けする能力を有すること、すなわち、標識誘導の制御を有することが有益であろう。ラベルは時間をかけて保持され、隣接セルに転送されないことになるように創始細胞のすべての子孫に渡され、安定かつ不可逆的な標識方法は重要です。
より最近では、細胞標識の遺伝的アプローチが開発されました。これらのシステムでは、細胞特異的プロモーターは、loxP隣接障害を除去し、例えば、緑色蛍光タンパク質またはΒガラクトシダーゼレポーター遺伝子9-13などのレポーター遺伝子の発現を可能にするために、Creリコンビナーゼの発現を誘発するために使用することができます。このアプローチだけでなく、細胞やその子孫の追跡を可能にするだけでなく、細胞であることが可能オレーションや分子特性。単一細胞レベルでの細胞の追跡は、単一の蛍光レポーター遺伝子の発現を誘導することにより可能となりました。このシステムの一つの重要な制約は、細胞の非常に低い割合が標識されている場合にのみ、個々のクローンを分離し、追跡することが可能であるという事実です。レポーターを使用することができ、この限界を克服するために、多色。多色標識を使用する場合は、同じニッチにおける隣接セルの差動運命の追跡を効率的に14-17を達成することができます。最近、Brainbow(BR)の対立遺伝子の多様性は、Cre / lox系を利用して、複数の蛍光レポーター遺伝子の確率的な発現を可能にする、系統トレーシング実験のために開発されました。 Cre / lox系が認識し、そのようなloxP部位として特定のDNA配列に結合するCreリコンビナーゼ酵素、から構成されています。以下のCreリコンビナーゼの結合は、部位特異的組換えが発生し、loxP配列の除去挟まれたシーケンスがresultin引き起こします種々の蛍光タンパク質の発現のランダムグラム(メカニズムを以下に説明します)。 Brのラインの様々な(レビュー16,18,19を参照してください )使用できます。 Brの株の主な違いは、2(BR 2.0)、3(Br1.0)から4(Br1.1、Br2.1)蛍光遺伝子に至るまで、カセットに含まれる蛍光遺伝子の数(I)の違いを含めますこと、(ii)相互に向いlox部位の存在が使用lox部位の(iii)のタイプ、および(iv)式または蛍光遺伝子発現の沈黙の前のCre活性化に、遺伝子反転(Br2.0-2.1)を可能にします。最近設立されたBR3は、ニューロンの多色イメージングのための改良された方法を提供しています。この転写産物の主な特徴の一つは、最高級の神経細胞20を処理するのであっても染色を可能にする光安定ファルネシル化蛍光タンパク質の新しいセットが含まれていることです。
重要なことは、Brのカセットの異なるバージョンは、ニューロンの特定はThy1 PRを含んでいてもよいですomoterまたは偏在的CAG(CMV)プロモーターを表明しました。 Brのトランスジェニックマウスのいくつかは、単一のBr導入遺伝子を含有することができる一方で、最終的に、他の人がそれによって各細胞内で発現される色の組み合わせの可能性の膨大な数の生産を可能にする、複数の導入遺伝子のコピーからなってもよい(例えば、16を参照のこと)。
私たちの研究では、Brの2.1 カセット 21 を含んで R26R-紙吹雪のマウスを使用していました。 Br2.1は、一意のCre媒介DNA逆位と理由loxP部位( 図1)の逆数の向きだけでなく切除を可能にするように設計されています。このように、色の変化につながるこれらの反転/切除イベントは限りのCreが16存在するとして継続することができます。そのため、一時的な誘導性Cre発現系はBr2.1を用いた信頼性の細胞追跡のために必須です。 図に示すように。 1、Br2.1はloxP隣接ネオR -casse続いユビキタスCAGプロモーターが含まれています転写の障害として作用するTTEは、それは、二つのタンデムに配置さ黄緑4蛍光レポーター遺伝子をコードする(GFP)、(YFP)、赤色(RFP)、シアン(CFP)蛍光タンパク質、が続きます。いいえ蛍光は、Creの活性化に先立って表現されていません。 Creリコンビナーゼの誘導は、所定の細胞に4蛍光タンパク質の一つのランダムな発現を可能にする新Rカセットの除去を引き起こします。第二のセグメントは、loxP隣接RFPと逆CFPが含まれていながら、最初のセグメントは、loxP隣接GFPと逆YFPが含まれています。これらのDNAセグメントは、連続している限り、Creリコンビナーゼが存在するように、(逆向きであるのloxPを使用して)、反転、または切除されてもよいです。したがって、一過性と制御のCre導入遺伝子を使用する必要があります。 Br2.1カセットは、信号位置に基づく重複の排出量とを区別するための優れたシステムを提供します:YFPおよびRFPの発現は、細胞質である、GFPが核であり、CFPは、細胞膜に結合されます。 GFPおよびRFPの排出が容易に従来の蛍光顕微鏡で分離されています。 YFP / GFP / CFPの排出を分離するために、スペクトル共焦点イメージングシステムが必要とされます。要するに、Br2.1カセットは、各標的細胞における4つの異なる蛍光遺伝子のうち1つ、ランダム誘導性、および組織特異的発現を可能にします。色の組み合わせの多数が必要とされるときに、実際には、一つは、このように各セルの2色タグの発現および10に可能な色の組み合わせの数を上げ、その結果、Br2.1の2対立遺伝子を含むホモ接合性のマウスを生成することができカセットの複数のコピーがそのゲノム16に統合されたので、22。Brのマウス系統の一部は、可能な色の組み合わせのはるかに多数の発現を可能にします。しかし、ほとんどの場合、単一Br2.1対立遺伝子によって設けられた4つの色の組み合わせで十分です。ここで提供されたプロトコルに続いて、一つはSPECTRの比較的簡単なセットアップを使用してこの方法を確立することができますキャリブレーションのための任意の必要がある場合はほとんどないとアル顕微鏡。
ここでは、角膜上皮の系譜トレース実験のために、単一Br2.1対立遺伝子を含んでR26R-紙吹雪マウスの使用に適合プロトコルを提供します。このトランスジェニックマウス株は、腸ガン25における幹細胞活性の存在を結腸21,23および角膜上皮幹細胞22,24の起源と運命を研究するため、ならびに巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)で腎臓足細胞を特徴付けるために使用されています17。
リネージュトレース実験は、長年にわたって行われてきました。最近の技術の向上と紙吹雪のマウス株の出現は、研究のための新たな道を開きました。現在、研究者らは、市販の組織特異的Creをライン、ノックアウトマウスおよびトランスジェニックマウスの多くの恩恵を受けることができます。これは、堅牢で信頼性の高いデータを提供しながら、骨の折れる練習を回避し、基本的な専門知識を持つ科学的問題に対処するための多彩な実験系を設計するための機会を提供します。
R26R-紙吹雪マウスは、効率的な追跡および生体内の細胞の性質や挙動を研究するためのエレガントなツールです。システムが確立するのは簡単であり、それは、胚発生の間に単一細胞の非侵襲的系譜トレースを可能にする幹細胞の再生を恒常性の下で、またはそのような損傷、炎症および癌などの異なる状況下で。入手データは、堅牢なDESCRIPTを提供定量化の方法で標的細胞、クローン細胞増殖および細胞遊走の生存のイオン。重要なステップは、確実に正確な発達段階で効率的な組織特異的標識を可能にすることができる適切な遺伝的マウス系統を選択することであろう。このシステムの1つの制限は、生体を監視するために、組織がアクセス可能で、透明でなければならないということです。同様に、生きている動物内の厚い組織を追跡するのみ二光子または多光子顕微鏡法によって容易にすることができます。しかし、細胞の追跡は、死後の組織切片上で可能であり、それはCLARITY方法32,33により透明になるように変換された後、おそらく無傷組織を研究することができます。考慮すべきもう一つの制限は、同じフルオロフォアを発現する隣接セルは、おそらく同じクローン系統に属しているが、それは彼らがランダムに同じ蛍光遺伝子を発現した独立した細胞起源に由来してもよいこともまた可能であることです。このpossibili多数の色の組み合わせを可能にするために、複数のBr対立遺伝子を使用した場合tyが非常ににくくなります。
将来的には、利用可能な遺伝子ツール( すなわち、ノックアウト、ノックイントランスジェニックマウスモデル)と紙吹雪システムを組み合わせることにより、遺伝子と健康と病理学におけるその変異の研究を可能にします。同様に、異なるシステム摂動の下でトレース系統(すなわち、細胞ニッチの破壊、レーザー媒介細胞除去、薬物治療を幹)細胞の運命決定にシグナル伝達経路の関与に新たな洞察をもたらすでしょう。最終的には、蛍光および生物発光標識の組合せ使用は、シグナル伝達経路およびエッジ顕微鏡を切断する遺伝記者は、研究者が自分の母国の環境で周囲にどのように対応するか、単一の細胞を学習するための堅牢なシステムを提供します。
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |