In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Durante el desarrollo embrionario, el tejido y la morfogénesis de órganos se realizan a través de un programa preciso que puede ser descrito en términos de proliferación celular, la migración celular y la especificación de linaje 1-4. Estos procesos biológicos también están involucrados en mantener la homeostasis de los tejidos adultos, que requiere la regeneración de células madre. Rastreo de linaje, la identificación y el seguimiento de la progenie de un tipo específico de población celular, proporciona una herramienta importante para el estudio de la embriogénesis y frenar la homeostasis celular. De hecho, cada vez se utiliza en muchos campos de la investigación. Particularmente, el trazado de linaje se convirtió en una herramienta esencial para identificar el origen y el destino de las células madre en la homeostasis y el cáncer de desarrollo. Esto es porque puede proporcionar información esencial acerca de cómo la célula se comporta en el contexto del tejido intacto o organismo, con mínima intervención experimental, en contraste con el aislamiento de células y en cultivo o in vitro transplantatien que puede resultar en sesgo no deseado.
Tradicionalmente, colorantes tales como carbocianina soluble en lípidos, que incorporan en la membrana plasmática de las células, se utilizaron para el rastreo linaje. Aunque estos tipos de experimentos se han llevado con éxito a importantes descubrimientos y conceptos seminales de forma en la biología del desarrollo 5,6, tienen algunas limitaciones, incluyendo la dificultad para controlar la especificidad de las células diana, el impacto no deseado del colorante sobre el comportamiento celular y la dilución de la etiqueta con el tiempo. Nucleótidos enfoques de etiquetado analógica han permitido documentar la existencia de "células de la etiqueta de retención" que presumiblemente corresponden a quiescent células madre 7,8 lento ciclismo. Sin embargo, mientras que esta técnica podría demostrar la presencia de células en ciclo lento basado en la cinética de proliferación durante un periodo de tiempo limitado que no podía proporcionar conocimientos sustanciales con respecto a la funcionalidad de las células madre. Un metanfetamina linaje trazado óptimometo- debe minimizar el efecto del etiquetado sobre las propiedades de la celda marcada, su progenie, o sus vecinos. Además, sería beneficioso tener un control sobre la inducción de etiquetado, es decir, para tener la posibilidad de etiquetar la población celular de interés en una etapa y de manera dependiente del tiempo, así como de una manera única célula (clonal). Un método de marcaje estable e irreversible que se transmite a toda la progenie de la célula fundador es importante para que la etiqueta se mantendría en el tiempo, y no se transfiere a las células vecinas.
Más recientemente, se han desarrollado enfoques genéticos de etiquetado celular. En estos sistemas, los promotores específicos de células pueden utilizarse para desencadenar Cre expresión de la recombinasa con el fin de eliminar un control de carretera loxP-flanqueado y permitir la expresión de genes indicadores tales como la proteína fluorescente verde o Β-galactosidasa genes informadores 9-13. Este enfoque permite no sólo el seguimiento de las células y su progenie, pero también permite que la célula esolation y caracterización molecular. Seguimiento de la célula en el nivel de células individuales se hizo posible por la inducción de la expresión de un solo gen reportero fluorescente. Una limitación importante de este sistema es el hecho de que sólo cuando porcentaje muy bajo de células se etiqueta es posible separar y rastrear los clones individuales. Para superar esta limitación reporteros multicolor pueden ser utilizados. Cuando se utiliza el etiquetado multicolor, el seguimiento del destino diferenciado de las células vecinas en el mismo nicho se puede lograr de manera eficiente 14-17. Recientemente, una variedad de Brainbow (Br) alelos se han desarrollado para los experimentos de rastreo de linaje, lo que permite una expresión estocástica de múltiples genes reporteros fluorescentes que utilizan el sistema Cre / lox. El sistema Cre / lox se compone de la enzima recombinasa Cre, que reconoce y se une a secuencias específicas de ADN tales como sitios loxP. Después de la unión de la recombinasa Cre, sitio de recombinación específica se produce, lo que provoca la eliminación de secuencias loxP flanqueado resulting en la expresión aleatoria de diferentes proteínas fluorescentes (el mecanismo se describe a continuación). Una variedad de líneas Br están disponibles para su uso (ver comentarios 16,18,19). Las principales diferencias entre las cepas Br incluyen (i) las diferencias en el número de genes fluorescentes incluidas en el casete, que van desde 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) a 4 (BR1.1, Br2.1) genes fluorescentes , (ii) la presencia de sitios lox recíprocamente orientadas para permitir la inversión de gen (Br2.0-2.1), (iii) el tipo de sitios lox utilizados, y (iv) la expresión o silencio de la expresión del gen fluorescente antes de la activación Cre. El Br3 recientemente establecida ofrece un método mejorado para la imagen multicolor de las neuronas. Una de las principales características de esta transcripción es que contiene un nuevo conjunto de proteínas fotoestables farnesylated fluorescentes, que permiten una tinción incluso de los mejores neuronal procesa 20.
Es importante destacar que las diferentes versiones de cassettes Br pueden contener el específica neuronal Thy1 promoter o la doquier expresó CAG (CMV). Por último, mientras que algunos de los ratones transgénicos Br puede contener un único transgén Br, otros pueden consistir en múltiples copias del transgén, lo que permite la producción de un inmenso número de posibilidades de combinaciones que se expresa en cada célula (por ejemplo, véase 16).
En nuestro estudio, hemos utilizado el ratón R26R-Confeti que contiene el Br 2,1 casete 21. Br2.1 está especialmente diseñado para permitir que las inversiones de ADN mediada por Cre y no sólo escisiones Debido a la orientación recíproca de los sitios loxP (Figura 1). Por lo tanto, estos acontecimientos inversión / escisión que conducen al cambio de color pueden continuar mientras Cre está presente 16. Por esa razón, un sistema de expresión inducible Cre temporal es esencial para el seguimiento fiable de células usando Br2.1. Como se muestra en la figura. 1, la Br2.1 contiene un promotor CAG ubicua seguido por loxP-flanqueado Neo R -cassette, que actúa como un control de carretera de la transcripción, que es seguido por 4 genes fluorescentes reportero, codificación de verde (GFP), amarillo (YFP), rojo (RFP) y cian (PPC) proteínas fluorescentes, colocados en dos tándems. No fluorescencia se expresa antes de la activación Cre. La inducción de la recombinasa Cre provoca la eliminación de la casete Neo-R que permite la expresión aleatoria de una de las 4 proteínas fluorescentes en una célula dada. El primer segmento contiene GFP-loxP flanqueado y una YFP invertido, mientras que el segundo segmento contiene RFP-loxP flanqueado y una PPC invertido. Estos segmentos de ADN pueden ser invertidos de forma continua (utilizando loxP que está en orientación inversa), o extirpados, siempre y cuando la recombinasa Cre está presente. Por lo tanto, se debe utilizar un transgen Cre transitoria y controlada. El casete Br2.1 proporciona un excelente sistema para distinguir entre las emisiones de solapamiento de la ubicación de la señal: la expresión de YFP y RFP es citoplasmática, la GFP es nuclear y la PPC se une a la membrana celular. GFPy las emisiones de RFP se separan fácilmente por microscopía de fluorescencia convencional. Con el fin de separar las emisiones de YFP / GFP / CFP, se necesita un sistema de imagen confocal espectral. En total, el casete Br2.1 permite la expresión específica al azar, inducible, y el tejido de uno de cada cuatro genes fluorescentes distintos en cada célula diana. De hecho, cuando se necesita un mayor número de combinaciones de colores, se puede generar ratones homocigotos que contiene 2 alelos de Br2.1, lo que resulta en la expresión de 2 etiquetas de color para cada célula y en el aumento del número de posibles combinaciones de colores para 10 22. Algunas de las cepas de ratón Br permiten la expresión de un número mucho mayor de posibles combinaciones desde múltiples copias del casete se integraron en su genoma 16. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las cuatro combinaciones de color proporcionadas por un único alelo Br2.1 son suficientes. Siguiendo el protocolo aquí proporcionada, se puede establecer este método utilizando una relativamente sencilla configuración de SPECTRal microscopía con poca o ninguna necesidad de calibración.
Aquí proporcionamos un protocolo adaptable para el uso de los ratones R26R-confeti que contienen un único alelo Br2.1, para el rastreo de linaje experimentos del epitelio corneal. Esta cepa de ratón transgénico ha sido utilizado para estudiar el origen y el destino de cáncer de colon 21,23 y células madre epiteliales de la córnea 22,24, la presencia de actividad de células madre en el cáncer intestinal 25, y para la caracterización de podocitos renal en glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GSF) 17.
Lineage experimentos de rastreo han llevado a cabo durante muchos años. Los últimos avances tecnológicos y la aparición de las cepas de ratón confeti abrieron nuevas vías para la investigación. Hoy en día, los investigadores pueden beneficiarse de un gran número de disponibles comercialmente específicos de tejido Cre líneas, los ratones knockout y los ratones transgénicos. Esto proporciona una oportunidad para el diseño de sistemas versátiles experimentales para abordar cuestiones científicas con experiencia básica, evitando la práctica laboriosa, mientras que proporciona datos sólidos y fiables.
Ratones R26R-confeti son una herramienta elegante para el seguimiento eficiente y el estudio de la naturaleza y el comportamiento de las células en un organismo vivo. El sistema es fácil de establecer y permite el rastreo de linaje no invasiva de células individuales durante la embriogénesis, la regeneración de células madre bajo homeostasis, o bajo diferentes circunstancias tales como lesión, inflamación y cáncer. Los datos obtenible proporciona un descripta robustaion de la supervivencia de las células diana, la expansión clonal de células y la migración celular, de una manera cuantificable. Un paso crítico sería elegir la cepa de ratón genético apropiado que puede permitir con fiabilidad el etiquetado específico de tejido eficiente en una etapa de desarrollo precisa. Una limitación de este sistema es que para el seguimiento de un organismo vivo, el tejido debe ser accesible y transparente. Del mismo modo, el seguimiento de un tejido grueso en un animal vivo puede ser sólo facilitado por dos fotones o microscopía multi-fotón. Sin embargo, el seguimiento de celda disponible en secciones de tejido postmortem y quizás el tejido intacto puede estudiarse después de que ha sido transformado para convertirse en transparente por el método CLARITY 32,33. Otra limitación a tener en cuenta es que, aunque las células adyacentes que expresan el mismo fluoróforo probable que pertenecen al mismo linaje clonal, también es posible que se pueden derivar de origen celular independiente que expresa al azar el mismo gen fluorescente. Este possibilidad se hace muy poco probable cuando se utilizan múltiples alelos Br para permitir numerosas combinaciones.
En el futuro, combinando el sistema de confeti con herramientas genéticas disponibles (es decir, nocaut, modelos knockin y ratones transgénicos) que permitirá el estudio de los genes y sus mutaciones en la salud y la patología. Del mismo modo, el linaje de rastreo bajo diferentes perturbaciones del sistema (es decir, detener la destrucción nicho de células, mediada por láser de ablación celular, tratamiento farmacológico) aportará nuevos conocimientos sobre la participación de las vías de señalización en las decisiones del destino celular. En última instancia, el uso combinatorio de etiquetado fluorescente y bioluminiscencia, periodistas genéticos de las vías de señalización y corte microscopía borde será proporcionar a los investigadores un sistema robusto para aprender cómo las células solo responde a su entorno en su ambiente nativo.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |