In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Во время эмбрионального развития, тканей и органов морфогенез состоится через четкой программой, которая может быть описана в терминах клеточной пролиферации, миграции клеток и спецификации клонов 1-4. Эти биологические процессы также участвуют в поддержании гомеостаза взрослых тканей, что требует регенерации стволовых клеток. Lineage трассировка, идентификация и отслеживание потомства определенного типа клеток населения, является важным инструментом для изучения эмбриогенеза и гомеостаза клетки стволовые. Действительно, все чаще используется во многих областях исследований. В частности, линия трассировка стала важным инструментом в определении происхождения и судьбы стволовых клеток в гомеостаза и рака развития. Это потому, что он может предоставить важную информацию о том, как ведет себя клетка в контексте интактной ткани или организма, с минимальным вмешательством экспериментальной, в отличие от выделения клеток в пробирке и культуры или transplantatiна что может привести к нежелательной предвзятости.
Традиционно, красители, такие как жирорастворимые карбоцианиновых, которые включают в плазматической мембране клеток, были использованы для отслеживания клонов. Хотя эти типы экспериментов успешно привели к серьезным открытий и формы семенных концепций в биологии развития 5,6, они имеют некоторые ограничения, в том числе трудности для контроля специфичности клеток-мишеней, нежелательного воздействия красителя на поведение клеток и разведении этикетки с течением времени. Нуклеотидные подходы аналог маркировки позволили документирования существование медленной езды на велосипеде "ярлык сохраняя клетки", что по-видимому соответствуют покоя стволовых клеток 7,8. Тем не менее, в то время как этот метод может показать наличие медленных велосипедных элементов на основе распространения кинетики в течение ограниченного периода времени она не могла обеспечить существенные идеи относительно функциональности стволовых клеток. Оптимальное отслеживание происхождение метгии должны свести к минимуму влияние маркировки о свойствах отмеченной ячейке, ее потомства, или его соседей. Кроме того, было бы полезно иметь контроль над индукции маркировки, а именно, чтобы иметь возможность помечать клеточной популяции интереса на этапе и времени зависимым образом, а также в одной ячейке (клонального) образом. Стабильная и необратимый метод маркировки, которая передается на все потомство основателя ячейки важно, чтобы этикетка будут сохранены в течение долгого времени, и не передается в соседние клетки.
Совсем недавно были разработаны генетические подходы этикетки клеток. В этих системах, промоторы клеток могут быть использованы, чтобы вызвать экспрессию рекомбиназы Cre, чтобы удалить LoxP-пропускной пункт по бокам и позволить экспрессию репортерных генов, таких как зеленый флуоресцентный белок или Β-галактозидазы репортерных генов 9-13. Такой подход позволяет не только отслеживать клеток и их потомства, но также позволяет клеткаolation и молекулярная характеристика. Отслеживание сотового на уровне одной клетки стало возможным с помощью индукции экспрессии одного флуоресцентного гена-репортера. Одним из важных ограничений этой системы является то, что только тогда, когда очень низкий процент клеток помечена можно отделить и отслеживать индивидуальных клонов. Чтобы преодолеть это ограничение разноцветными журналисты могут быть использованы. При использовании многоцветного мечения, отслеживание дифференциального судьбы соседних клеток в той же нише, может быть достигнуто эффективно 14-17. Недавно различные Brainbow (BR) аллелей были разработаны для отслеживания клона экспериментов, позволяя стохастический экспрессию нескольких флуоресцентных репортерных генов, использующих систему Cre / LOX. Система Cre / LOX состоит из рекомбиназы фермента Cre, который распознает и связывается с специфических последовательностей ДНК, таких как сайты LoxP. После связывания Cre рекомбиназой, конкретного участка рекомбинация происходит, что приводит к последовательности удаление LoxP окружении resultinг в случайном экспрессии различных флуоресцирующих белков (механизм описан ниже). Разнообразие Br линий доступны для использования (см отзывы 16,18,19). Основные различия между штаммами Br включают (I) различия в количестве люминесцентных генов, включенных в кассете, от 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) 4 (Br1.1, Br2.1) флуоресцентных генов , (II) наличие взаимно ориентированных сайтов LOX, чтобы позволить инверсию гена (Br2.0-2.1), (III) тип LOX сайтов, используемых, и (IV) выражение или молчание экспрессии гена флуоресцентного до Cre активации. Недавно созданный Br3 предлагает улучшенный способ многоцветной визуализации нейронов. Один из основных особенностей этой стенограммы, что она содержит новый набор фотостабильных farnesylated флуоресцентных белков, которые позволяют еще окрашивание лучших нейронов обрабатывает 20.
Важно отметить, что различные версии Br кассет может содержать нейронную специфику Thy1 прomoter или повсеместно выразил CAG (ЦМВ) промотор. Наконец, в то время как некоторые из трансгенных мышей Br может содержать один Br трансген, другие могут состоять из нескольких трансгенных копий, тем самым позволяя производство огромного числа возможностей для цветовых комбинаций должен быть выражен в каждой клетке (например, см 16).
В нашем исследовании мы использовали мышь R26R-Confetti, который содержит Br 2,1 кассету 21. Br2.1 однозначно разработан, чтобы позволить Cre-опосредованные инверсии ДНК и не только из-за эксцизии обратной ориентации LoxP сайтов (рисунок 1). Таким образом, эти инверсии / вырезания события, которые приводят к изменению цвета можно продолжать так долго, как Cre присутствует 16. По этой причине, индуцируемый временная система экспрессии Cre важно для надежного отслеживания клеток с использованием Br2.1. Как показано на рисунке. 1, то Br2.1 содержит вездесущий промотор CAG последующим LoxP-окружении Нео R -casseTTE, который действует как транскрипционный контрольно-пропускном пункте, который затем в течение 4 флуоресцентных генов-репортеров, кодирование для зеленого (GFP), желтый (YFP), красный (RFP) и голубой (СФП) флуоресцентные белки, расположенных в двух тандемов. Нет флуоресценции не выражается до Cre активации. Индукция Cre рекомбиназы вызывает удаление кассеты нео-R, позволяющей случайную экспрессию одного из 4-х флуоресцентных белков в данной клетке. Первый сегмент содержит LoxP-окружении GFP и обратную YFP, в то время как второй сегмент содержит LoxP-окружении RFP и обратную CFP. Эти сегменты ДНК могут быть инвертированы непрерывно (с помощью LoxP, которая находится в обратной ориентации), или вырезали, пока Cre рекомбиназа присутствует. Таким образом, переходные и контролировать Cre трансгена следует использовать. Кассета Br2.1 обеспечивает отличную систему для различения перекрывающихся выбросов от местоположения сигнала: выражение YFP и ОПП цитоплазматический, то GFP ядерная и СФП связан с клеточной мембраной. GFPи RFP выбросы легко отделяются от обычной люминесцентной микроскопии. Для того чтобы отделить выбросов YFP / GFP / CFP, спектральный система конфокальной микроскопии необходимо. В общей сложности, кассета Br2.1 позволяет случайное, индуцируемый и тканеспецифическую выражению одного из четырех различных флуоресцентных генов в каждой клетки-мишени. В самом деле, когда большее количество цветовых комбинаций необходимо, можно генерировать гомозиготных мышей, которые содержат от 2 аллели Br2.1, что приводит к экспрессии 2 цветных меток для каждой ячейки и в увеличении числа возможных комбинаций цвета до 10 22. Некоторые из штаммов Br мыши позволяют выражение гораздо большему числу возможных цветовых комбинаций, так как множественные копии кассеты были интегрированы в их геном 16. Тем не менее, в большинстве случаев, четыре цветовые комбинации, представленные одной Br2.1 аллеля являются достаточными. После протоколом, здесь можно установить этот метод с использованием относительно простой установку Спектраль микроскопии с мало, если какой-либо необходимости для калибровки.
Здесь мы предлагаем адаптируемый протокол для использования мышей R26R-конфетти, которые содержат одну аллель Br2.1, для отслеживания клона экспериментов эпителия роговицы. Это трансгенный штамм мыши была использована для изучения происхождения и судьбы толстой кишки 21,23 и роговицы эпителиальных стволовых клеток 22,24, наличие стволовых клеток в деятельности рака кишечника 25 и для характеристики почек подоцита в фокальной-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) 17.
Lineage трассировки эксперименты были проведены в течение многих лет. Последние технологические усовершенствования и появление штаммов конфетти мыши открывает новые возможности для исследований. Сегодня исследователи могут извлечь выгоду из большого количества коммерчески доступных ткане-специфических Cre линии мышей с нокаутом, и трансгенных мышей. Это дает возможность для разработки универсальной системы для экспериментальных решении научных вопросов с основной экспертизы, избегая трудоемкого практику, обеспечивая надежные и достоверные данные.
Мышей R26R-Конфетти являются элегантный инструмент для эффективного отслеживания и изучения природы и поведения клеток в живом организме. Система легко устанавливается и позволяет неинвазивным клонов отслеживание отдельных клеток во время эмбриогенеза, стволовые клетки под регенерацию гомеостаза, или при других обстоятельствах, таких как травмы, воспаления и рака. Затем полученный данных обеспечивает надежную DESCRIPTион выживания клеток-мишеней, клональной экспансии клеток и миграции клеток, в количественной форме. Важным шагом будет выбрать подходящий генетический штамм мыши, что позволяет надежно разрешить эффективно тканеспецифическую маркировку в точном стадии развития. Одним из ограничений этой системы является то, что для мониторинга живой организм, ткань должна быть доступной и прозрачной. Точно так же, отслеживания толстый ткань в живом может быть только способствовали два фотона или нескольких фотонов микроскопии. Тем не менее, отслеживание сотового можно по разделам посмертных тканей и, возможно, неповрежденной ткани могут быть изучены после того, как был преобразован в стали прозрачными методом CLARITY 32,33. Другим ограничением, чтобы считать, что, хотя соседние клетки, которые экспрессируют один и тот же флуорофор вероятно, принадлежат к той же линии клональной, это также возможно, что они могут быть получены из независимого клеток происхождения, которые случайным образом выразил ту же флуоресцентный ген. Это possibiliти становится очень маловероятно, при использовании нескольких аллелей Br чтобы многочисленные цветовые комбинации.
В будущем, объединяя систему Confetti с имеющихся генетических инструментов (т.е., нокаут, Достучаться и трансгенных мышах) позволит изучение генов и их мутаций в области здравоохранения и патологии. Точно так же, линия трассировки при различных возмущениях системы (т.е., стволовые клетки уничтожение нишу, лазерная абляция опосредованной клеточной медикаментозное лечение) принесет новые идеи на пути участия в судьбе клеток решений сигнализации. В конечном счете, комбинаторной использование флуоресцентного и биолюминесценции маркировки, генетические корреспонденты сигнальных путей и передовые микроскопии обеспечит исследователям надежную систему, чтобы узнать, как один клетки реагируют на их окружения в их родной среде.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |