In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
배아 발생 동안, 조직 및 기관의 형태 형성은 세포 증식, 세포 이동 및 계통 1-4 명세서의 관점에서 기술 될 수 정확한 프로그램을 통해 일어난다. 이러한 생물학적 과정은 세포 재생 줄기 필요 성인 조직의 항상성을 유지에 참여하고 있습니다. 리니지 추적, 식별 및 세포 집단의 특정 유형의 자손의 추적, 배아를 연구하고 세포의 항상성을 막기위한 중요한 도구를 제공합니다. 실제로, 더욱 연구의 많은 분야에서 사용되고있다. 특히, 혈통 추적은 항상성과 암 발달에 기원과 줄기 세포의 운명을 식별에 필수적인 도구가되었다. 이 세포 분리에 체외 배양 또는 transplantati에 대조적으로, 최소한의 실험적인 개입은 그대로 세포 조직 또는 유기체의 컨텍스트에서 동작하는 방법에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있기 때문이다그에 원치 않는 편견의 원인이 될 수 있습니다.
전통적으로, 세포의 세포막에 통합 같은 지용성 카보시 등의 염료, 리니지 추적을 위해 사용되었다. 이런 종류의 실험을 성공적으로 발생 생물학 5,6- 주요 발견과 모양 독창적 개념을 주도하고 있지만, 그들은 타겟 세포의 특이성을 제어하기 어려운, 셀 동작에 염료의 원치 않는 영향 희석을 포함한 몇 가지 제한을 가지고 시간이 지남에 따라 라벨. 염기 아날로그 표시 방식은 아마도 줄기 세포 7,8은 대기에 해당 "레이블 유지 셀"천천히 자전거의 존재를 문서화 사용할 수 있습니다. 이 방법은 제한된 기간 동안 증식 느린 동역학에 기초한 순환 세포의 존재를 입증 할 수있는 동안 그러나 줄기 세포의 기능과 관련된 실질적인 통찰력을 제공 할 수 없었다. 최적의 혈통 추적 메타odology는 현저한 세포, 그 자손, 또는 이웃의 표시 특성에 미치는 영향을 최소화한다. 또한,이 단계 및 시간 의존적 방식으로뿐만 아니라 단일 세포 (클론) 방식에 대한 관심이 세포 집단을 태그 할 수있는 능력을 갖도록, 즉, 라벨 유도에 제어를 갖는 것이 유익 할 것이다. 레이블이 시간 유지하고, 인접하는 셀에 전사되지 해 지도록 설립자 셀의 모든 자손에게 전달되어 안정하고 비가역적인 표식 방법은 중요하다.
최근에, 세포의 표지 유전자 접근법이 개발되었다. 이러한 시스템에서, 세포 특이 적 프로모터는 녹색 형광 단백질 또는 Β 갈 락토시다 제 리포터 유전자 9-13 같이 리포터 유전자의 발현은 loxP-측면 장애물을 제거하고 허용하기 위해 Cre 호텔 재조합 발현을 유발하는데 사용될 수있다. 이 방법뿐만 아니라 세포 및 그 자손의 추적을 가능하게하지만, 또한 세포가 허용olation 및 분자 특성. 단일 세포 수준에서의 셀 추적은 단일 형광성 리포터 유전자의 발현 유도에 의해 가능하게되었다. 본 시스템의 하나의 중요한 한계는 세포의 매우 낮은 백분율이 각각의 클론을 분리하고 추적 할 수있다 표지 만 사실이다. 여러 가지 빛깔의 기자가 사용할 수있는 이러한 한계를 극복합니다. 다색 표시를 사용하는 경우, 동일한 틈새에서 인접 셀의 차동 운명의 트래킹을 효율적으로 14-17을 달성 할 수있다. 최근 Brainbow (BR) 대립 유전자의 다양한 Cre 호텔 / LOX 체계를 이용하여 다수의 형광 리포터 유전자의 발현을 활성화 스토캐스틱 리니지 추적 실험을 위해 개발되었다. Cre 호텔 / LOX 시스템은 인식하고 그러한에 loxP 사이트와 같은 특정 DNA 서열에 결합 Cre 호텔 재조합 효소로 구성되어 있습니다. 다음은 Cre 호텔 재조합 효소의 결합은, 사이트 특이 적 재조합이 발생,에 loxP의 제거 측면 시퀀스 resultin 일으키는다른 형광 단백질 발현의 임의의 g (기구에 대하여 설명한다). 브롬 라인의 다양한 (리뷰 16,18,19 참조)를 사용할 수 있습니다. 브롬 균주 사이의 주요 차이점은 2 (BR 2.0), 3 (Br1.0)에서 4 (Br1.1, Br2.1) 형광 유전자에 이르기까지, 카세트에 포함 된 형광 유전자의 수 (I)의 차이를 포함 (ⅱ) 왕복 배향 LOX 사이트의 존재는 사용되는 LOX 사이트 (III) 타입, (ⅳ) 식 또는 형광 유전자 발현의 침묵 전에 Cre 호텔 활성화에, 유전자 반전 (Br2.0-2.1)을 허용한다. 최근에 설립 Br3 등의 트리 뉴런의 여러 가지 빛깔의 이미징을위한 개선 된 방법을 제공합니다. 이 전사의 주요 특징 중 하나는 최상의 신경의 염색에도 20 처리를 가능 광 안정성 farnesylated 형광 단백질의 새로운 세트를 포함한다는 것이다.
중요한 것은, 브롬 카세트의 다른 버전 Thy1 홍보 신경 특정을 포함 할 수있다omoter 또는 재하는 CAG (CMV) 프로모터를 표명했다. 브롬 트랜스 제닉 마우스 중 일부는 단일 브롬 형질 전환 유전자를 함유 할 수있는 동안 마지막으로, 다른하여 각 셀에서 발현되는 색상의 조합 가능성의 엄청난 수의 생산을 허용하는, 다중 트랜스 유전자 카피로 구성 될 수있다 (예 16 참조).
우리의 연구에서, 우리는 브롬 2.1 카세트 (21)를 포함하는 R26R – 색종이 마우스를 사용했다. Br2.1는 고유 Cre 호텔 – 중재 DNA 반전 때문에에 loxP 사이트 (그림 1)의 역수 방향뿐만 아니라 절개를 할 수 있도록 설계되었습니다. 따라서, 색 변화로 이어질 이러한 반전 / 절단 이벤트는 한 Cre 호텔 16 존재로 계속 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로, 유도 시간 Cre 호텔 발현 시스템은 안정적인 셀 추적 Br2.1을 사용을 위해 필수적이다. 도면에 도시 된 바와 같이. 1, Br2.1는에 loxP-측면 네오 R의 -casse 다음 유비쿼터스 CAG 프로모터를 포함전사 장애물 역할을 TTE는, 그 두 탠덤에 위치 노란색, 녹색, 4 형광 리포터 유전자, 인코딩 (GFP), (YFP), 적색 (RFP) 및 시안 (CFP) 형광 단백질,옵니다. 형광은 Cre 호텔 활성화 이전에 표시되지 않습니다. Cre 호텔 재조합 효소의 유도는 특정 세포에 4 형광 단백질 중 하나의 임의의 표현을 가능 R 네오 카세트의 제거를 야기한다. 두 번째 세그먼트에 loxP-측면 RFP와 반전 CFP을 포함하는 동안 첫 번째 세그먼트는,에 loxP-측면 GFP 및 반전 YFP가 포함되어 있습니다. 이러한 DNA 세그먼트는 연속 한 Cre 호텔 재조합 효소가 존재하는 바와 같이, (반대 방향 인에 loxP 사용) 반전, 또는 절제 될 수있다. 따라서, 과도하고 제어 Cre 호텔의 형질 전환 유전자를 사용해야합니다. YFP의 발현 및 RFP는 세포질이며, GFP는 핵이고 CFP는 세포막에 결합된다 Br2.1 카세트 위치 신호에 중첩 배출 구별하는 우수한 시스템을 제공한다. GFP및 RFP 배출량은 쉽게 기존의 형광 현미경으로 분리된다. YFP / GFP / CFP 배출을 분리하기 위해, 스펙트럼 공 초점 영상 시스템이 필요하다. 전부, Br2.1 카세트는 각 대상 셀에 1 ~ 4 중 별개의 형광 유전자의 무작위 유도하고, 조직 특이 적 발현을 할 수 있습니다. 컬러 조합의 더 큰 수 필요할 때 실제로, 하나 따라서 각 셀의 2 색 태그 식 및 (10)에 가능한 색 조합의 수를 높여 결과적 Br2.1 2 대립 유전자를 포함하는 동형 접합체 생쥐를 생성 할 수있다 카세트의 여러 복사본들이 유전체 (16)에 통합 된 이후 22. 브롬 마우스 균주의 일부는 가능한 색 조합의 더 큰 수의 표현을 가능하게한다. 그러나, 대부분의 경우, 하나의 대립 유전자 Br2.1 의해 제공된 네 가지 색상의 조합은 충분하다. 여기에 제공된 프로토콜에 따라, 하나는 spectr의 비교적 간단한 설치 프로그램을 사용하여이 방법을 설정할 수 있습니다교정 조금있는 경우 필요에 알 현미경.
여기에서 우리는 각막 상피의 혈통 추적 실험을 위해, 하나의 Br2.1 대립 유전자를 포함하는 R26R – 색종이 마우스의 사용에 대한 적응 프로토콜을 제공합니다. 이 트랜스 제닉 마우스 균주 결장 21,23 각막 상피 줄기 세포 (22, 24)의 원점과 거동을 연구에 사용 된, 및 국소 분절 사구체에서 신장 발 세포를 특성화 장암 25 줄기 세포 활성의 존재 (FSGS) 17.
리니지 추적 실험은 수년 동안 진행되어왔다. 최근의 기술 향상과 색종이 마우스 균주의 출현은 연구에 새로운 길을 열었다. 오늘은, 연구자들은 상업적으로 이용 가능한 조직 특이 Cre 호텔 라인, 녹아웃 마우스 및 형질 전환 마우스의 많은 혜택을 누릴 수 있습니다. 이것은 견고하고 신뢰할 수있는 데이터를 제공하는 동시에, 연습 힘드는 회피 기본적인 전문 과학적 질문 어드레싱 다목적 실험 시스템을 설계하기위한 기회를 제공한다.
R26R – 색종이 마우스는 효율적인 추적 및 살아있는 유기체 세포의 성격과 행동을 연구하기위한 우아한 도구입니다. 시스템 구축이 용이하며, 배아 발생 동안 단일 세포의 비 침습적 혈통 추적을 허용 줄기 세포 재생을 항상성하에, 또는 상해, 염증 및 암과 같은 상이한 상황. 얻을 수있는 데이터는 강력한 Descript를 제공정량 방식으로 대상 세포 클론 세포의 확장과 세포 이동의 생존의 이온. 중요한 단계는 확실하게 정확한 발달 단계에서 효율적인 조직 특정 표시를 허용 할 수 있습니다 적절한 유전 마우스 변형을 선택하는 것입니다. 이 시스템의 한 가지 제한은 생체 모니터링, 조직에 접근하고 투명해야한다는 것이다. 마찬가지로, 살아있는 동물 내에서 조직의 두께를 추적은 두 광자 또는 다중 광자 현미경에 의해 촉진 될 수있다. 그러나, 세포 추적은 사후 조직 섹션에 가능하며이 선명도 방법 (32, 33)에 의해 투명하게하기 위해 변환 된 후 아마도 손상 조직을 연구 할 수있다. 고려해야 할 또 다른 한계는 동일한 형광을 발현 인접 셀 가능성 동일한 클론 계보에 속할지라도, 그들은 임의로 동일한 형광성 유전자를 발현 독립적 인 기원 세포로부터 유도 될 수 있다는 것도 가능하다는 것이다. 이 possibili다수의 색상 조합을 허용하는 다수의 브롬 대립 유전자를 사용하는 경우가 매우 어려울 TY된다.
앞으로 유전자와 건강과 병리학에서의 돌연변이 연구를 허용합니다 가능한 유전 적 도구 (즉, 녹아웃, 올림피아 및 형질 전환 마우스 모델)와 색종이 시스템을 결합. 마찬가지로, 혈통 세포 운명 결정에 신호 전달 경로의 참여에 새로운 통찰력을 가져올 것이다 다른 시스템 섭동 (즉, 세포 틈새 파괴, 레이저 매개 세포 제거, 약물 치료, 줄기)에서 추적. 궁극적으로, 형광 및 생물 발광 라벨의 조합 사용은 가장자리 현미경을 신호 경로 및 절단의 유전 기자 연구자에게 그들의 자신의 네이티브 환경에서 주변에 대응하는 방법을 하나의 세포를 배울 수있는 강력한 시스템을 제공 할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |