In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
Durante o desenvolvimento embrionário, a morfogénese do tecido e órgão ter lugar através de um programa precisa que pode ser descrito em termos de proliferação celular, a migração celular e especificação linhagem 1-4. Estes processos biológicos estão também envolvidas na manutenção da homeostase dos tecidos adultos, o que requer a regeneração de células estaminais. Rastreamento de linhagem, a identificação e rastreio dos descendentes de um tipo específico de população celular, fornece uma importante ferramenta para o estudo da embriogênese e haste homeostase celular. Com efeito, é cada vez mais a ser utilizado em muitos campos da investigação. Particularmente, o rastreamento linhagem tornou-se uma ferramenta essencial na identificação da origem e destino das células-tronco na homeostasia e câncer desenvolvimento. Isto é porque pode fornecer informação essencial sobre a célula comporta-se como no contexto do tecido ou organismo intacto, com um mínimo de intervenção experimental, em contraste com o isolamento de células e cultura in vitro ou transplantatiem que pode resultar em viés indesejado.
Tradicionalmente, os corantes tais como carbocianina solúvel em lípidos, que incorporam-se na membrana plasmática das células, foram utilizadas para o traçado da linhagem. Embora estes tipos de experiências conduziram com sucesso a grandes descobertas e conceitos seminais conformados na biologia do desenvolvimento 5,6, eles têm algumas limitações, incluindo a dificuldade em controlar a especificidade das células alvo, o impacto indesejado do corante no comportamento das células e a diluição do rótulo ao longo do tempo. Nucleotídeo abordagens de rotulagem análogo permitiram documentar a existência de-ciclismo lento "etiqueta reter células" que presumivelmente correspondem às células-tronco quiescentes 7,8. No entanto, embora esta técnica foi demonstrada a presença de células em divisão lenta com base na cinética de proliferação ao longo de um período de tempo limitado não poderia fornecer informações importantes sobre a funcionalidade das células estaminais. Um meth linhagem rastreamento idealmeto- deve minimizar o efeito de rotulagem sobre as propriedades da célula marcada, a sua progenitura, ou os seus vizinhos. Além disso, seria benéfico ter controlo sobre a rotulagem de indução, isto é, ter a capacidade de codificar a população de células de interesse numa fase e tempo de forma dependente, bem como de uma maneira única célula (clonal). Um método de marcação estável e irreversível, que é passada para toda a progenia da célula fundador é importante para que a etiqueta seria retido ao longo do tempo, e não será transferida para as células vizinhas.
Mais recentemente, foram desenvolvidas abordagens genéticas da marcação celular. Nestes sistemas, os promotores específicos de células podem ser usadas para desencadear a expressão da recombinase Cre, a fim de remover um bloqueio flanqueado-loxP e permitir a expressão dos genes repórter, tais como a proteína fluorescente verde ou Β-galactosidase genes repórter 9-13. Essa abordagem permite não só o acompanhamento das células e sua progênie, mas também permite celular éolation e caracterização molecular. Rastreamento celular ao nível da célula única tornou-se possível pela indução da expressão de um único gene repórter fluorescente. Uma limitação importante deste sistema é o facto de que apenas quando muito baixa percentagem de células é marcado, é possível separar e rastrear clones individuais. Para superar esta limitação repórteres multicolor pode ser usado. Ao usar rotulagem multicolor, o rastreamento do destino diferencial das células vizinhas no mesmo nicho pode ser alcançado de forma eficiente 14-17. Recentemente, uma variedade de Brainbow (BR) alelos foram desenvolvidos para o rastreio de linhagem experiências, permitindo uma expressão estocástica de vários genes repórter fluorescentes, utilizando o sistema Cre / lox. O sistema Cre / lox consiste da enzima Cre recombinase, o qual reconhece e se liga a sequências de ADN específicas, tais como locais loxP. Após a ligação da recombinase Cre, ocorre recombinação específica do local, que faz com que as sequências de remoção de loxP flanqueado resulting na expressão aleatória de diferentes proteínas fluorescentes (o mecanismo é descrito abaixo). Uma variedade de linhas Br estão disponíveis para uso (ver comentários 16,18,19). As principais diferenças entre as estirpes Br incluem: (i) as diferenças no número de genes fluorescentes incluídos na cassete, variando de 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) a 4 (BR1.1, Br2.1) genes fluorescentes , (ii) a presença de locais lox mutuamente orientados para permitir a inversão do gene (Br2.0-2.1), (iii) o tipo de locais lox utilizados, e (iv) a expressão ou silêncio da expressão do gene fluorescente antes da activação Cre. O Br3 recentemente criada oferece um método melhorado para multicolor imagens de neurônios. Uma das principais características deste transcrito é que ele contém um novo conjunto de proteínas fluorescentes farnesilada fotoestável, que permitem uma coloração mesmo dos melhores neuronal processa 20.
Mais importante, as versões de diferentes cassetes de Br podem conter o específico neuronal Thy1 PRomoter ou o ubiquamente expresso CAG (CMV). Finalmente, enquanto alguns dos ratinhos transgénicos Br pode conter um único transgene Br, outras podem consistir de várias cópias do transgene, permitindo assim a produção de um imenso número de possibilidades de combinações de cores a serem expressos em cada célula (por exemplo, ver 16).
Em nosso estudo, utilizamos o mouse R26R-Confetti que contém a cassete Br 2.1 21. Br2.1 destina-se exclusivamente para permitir que as inversões de ADN mediada por Cre e não só porque as excisões da orientação recíproca dos locais loxP (Figura 1). Assim, esses eventos inversão / excisão que levam à mudança de cor pode continuar enquanto Cre está presente 16. Por essa razão, um sistema de expressão de Cre temporais indutível é essencial para o rastreamento de células fiável utilizando Br2.1. Tal como mostrado na Figura. 1, o Br2.1 contém um promotor ubíquo CAG seguido por flanqueado-loxP NeoR -cassette, que actua como uma barreira de transcrição, que é seguido por 4 fluorescentes genes repórter, que codifica para verde (GFP), amarelo (YFP), vermelha (RFP) e ciano (PCP) proteínas fluorescentes, posicionados em duas tandem. Nenhuma fluorescência é expressa antes da activação Cre. A indução da recombinase Cre faz com que a remoção da cassete neo-R permitindo a expressão aleatória de uma das proteínas fluorescentes em 4 de uma determinada célula. O primeiro segmento contém GFP flanqueado-loxP e um YFP invertida, enquanto que o segundo segmento contém RFP flanqueado-loxP e um PCP invertida. Estes segmentos de ADN podem ser continuamente invertido (usando loxP que está na orientação inversa), ou excisados, contanto que a recombinase Cre se encontra presente. Portanto, um transgene Cre transiente e controlada deve ser utilizada. A cassete Br2.1 fornece um excelente sistema para distinguir entre as emissões de sobreposição com a localização do sinal: a expressão de YFP e RFP é citoplasmática, a GFP é nuclear e PCP está ligada à membrana celular. GFPe emissões RFP são facilmente separados por microscopia de fluorescência convencional. A fim de separar as emissões YFP / GFP / CFP, é necessário um sistema de imagem confocal espectral. No total, a cassete Br2.1 permite a expressão específica aleatório, indutivel, e tecido de um de quatro genes fluorescentes distintas em cada uma das células alvo. De facto, quando é necessário um maior número de combinações de cores, pode-se gerar murganhos homozigóticos que contêm alelos de Br2.1 2, resultando assim na expressão de 2 etiquetas de cor para cada célula e no aumento do número de combinações possíveis de cores para 10 22. Algumas das estirpes de ratinho Br permitir a expressão de um muito maior número de possíveis combinações de cores desde que múltiplas cópias da cassete foram integradas no seu genoma 16. No entanto, na maioria dos casos, as quatro combinações de cor fornecidos por um único alelo Br2.1 são suficientes. Seguindo o protocolo proporcionado aqui, pode-se estabelecer esse método utilizando uma configuração relativamente simples de Spectrmicroscopia al com pouca ou nenhuma necessidade de calibração.
Aqui nós fornecemos um protocolo adaptável para a utilização dos ratinhos R26R-confetes que contêm um único alelo Br2.1, para o rastreio de linhagem experiências do epitélio da córnea. Esta estirpe de ratinho transgénico tem sido utilizada para estudar a origem e o destino dos dois pontos 21,23 e células estaminais epiteliais da córnea 22,24, a presença de actividade de células estaminais no cancro intestinal 25, e para a caracterização de podócitos renais em glomerulosclerose focal e segmentar (FSGS) 17.
Experimentos descrever a linhagem foram realizados durante muitos anos. Os recentes avanços tecnológicos eo surgimento das cepas Confetti rato abriu novos caminhos para a pesquisa. Hoje, os pesquisadores podem se beneficiar de um grande número de linhas disponíveis comercialmente Cre de tecidos específicos, camundongos knockout e ratos transgênicos. Isso fornece uma oportunidade para a concepção de sistemas experimentais versátil para abordar questões científicas com experiência básica, evitando a prática laboriosa, ao fornecer dados robustos e confiáveis.
Camundongos R26R-Confetti são uma ferramenta elegante para acompanhar e estudar a natureza eo comportamento das células em um organismo vivo eficiente. O sistema é fácil de estabelecer e permite o rastreamento de linhagem não-invasiva de células individuais durante a embriogênese, caule regeneração celular sob a homeostase, ou sob circunstâncias diferentes, como lesão, inflamação e câncer. Os dados obtidos fornece um descritivas robustaião de sobrevivência de células alvo, a expansão clonal de células e a migração de células, de um modo quantificável. Um passo crítico seria escolher o mouse estirpe genética apropriada que pode permitir de forma confiável rotulagem específica de tecido eficiente em um estágio de desenvolvimento precisa. Uma limitação deste sistema é que, para monitorização de um organismo vivo, o tecido deve ser acessível e transparente. Da mesma forma, o acompanhamento de um tecido grosso dentro de um animal vivo só pode ser facilitada por dois fótons ou microscopia multi-fotão. No entanto, é possível rastreamento de células em secções de tecido post-mortem, e talvez o tecido intacto pode ser estudado após ele ter sido transformado para se tornar transparente pelo método Clareza 32,33. Outra limitação a ser considerado é que embora as células adjacentes que expressam o mesmo fluoróforo provável pertencem à mesma linhagem clonal, é também possível que eles podem ser derivados de origem celular independente que expressa de forma aleatória do mesmo gene fluorescente. Esta possibility se torna muito pouco provável ao usar vários alelos Br para permitir inúmeras combinações de cores.
No futuro, combinando o sistema confetes com ferramentas genéticas disponíveis (ou seja, ko, modelos de ratinhos transgénicos e knockin) permitirá o estudo de genes e das suas mutações na saúde e na patologia. Da mesma forma, a linhagem rastreamento sob diferentes perturbações do sistema (ou seja, caule destruição nicho de células, laser mediada ablação de células, o tratamento medicamentoso) trará novos insights sobre o envolvimento de vias de sinalização nas decisões do destino da célula. Em última análise, o uso combinatória de marcação fluorescente e bioluminescência, repórteres genéticos de vias de sinalização e de corte microscopia borda irá fornecer aos pesquisadores um sistema robusto para aprender como as células único responder ao seu redor em seu ambiente nativo.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |