In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
在胚胎发育期间,组织和器官形态发生通过可以在细胞增殖,细胞迁移和谱系规范1-4来描述一个精确程序。这些生物过程也参与维持成人组织的平衡,这需要干细胞的再生。谱系追踪,识别和细胞群的特定类型的后代的跟踪,为研究胚胎及干细胞的体内平衡的重要工具。实际上,人们越来越多地用于研究许多领域。特别是,谱系追踪成为确定的起源和干细胞命运的稳态和肿瘤发生,发展的重要工具。这是因为它可以提供有关如何在细胞的行为与完整的组织或生物体的上下文重要信息,以最少的实验介入,而相比之下,细胞分离和体外培养或transplantati对可能导致不希望的偏差。
传统上,染料如脂溶性羰花青,其中并入细胞的质膜,被用于谱系追踪。尽管这些类型的实验已经成功地导致重大发现和形状精液概念在发育生物学5,6,它们有一定的局限性,其中包括的难度,以控制目标细胞的特异性,所述染料对细胞行为的不希望的影响,并稀释随着时间的推移的标签。核苷酸类似物标记方法已启用记录“标签滞留细胞”这大概是对应于静止期的干细胞7,8慢骑自行车的存在。然而,虽然该技术可以证明在一个有限的时间周期的基础上增殖动力学慢循环细胞的存在它不能提供关于干细胞的功能方面有显见解。最佳的谱系追踪甲基odology应尽量减少标签上标记的细胞,它的后代,或邻国的性能的影响。此外,这将是有益的对标签感应控制,即,以具有在一个阶段和时间依赖性,以及在单细胞(克隆)的方式来标记的目标细胞群的能力。即到创始人单元格的所有后代传递一个稳定的,不可逆的标记方法很重要,这样的标签将保留一段时间,而不是转移到相邻小区。
最近,开发了细胞标记基因的方法。在这些系统中,细胞特异性启动子可用于触发Cre重组酶的表达,以除去一个loxP的侧翼路障并允许报告基因的表达,例如绿色荧光蛋白或Β半乳糖苷酶报告基因9-13这种方法不仅使细胞及其后代的跟踪,但也允许细胞是olation和分子特征。在单细胞水平细胞跟踪由感应一个单个荧光报道基因的表达成为可能。该系统的一个重要的限制是,只有当细胞的比例很低标记可以分离和跟踪个别克隆。为了克服这个限制多色记者都可以使用。当使用多色标记,相邻小区的在相同的小生差动命运的跟踪可以有效地14-17实现。最近,多种Brainbow(BR)等位基因谱系追踪实验被开发,使得能够利用酶Cre / lox系统的多个荧光报告基因的随机表达。在的Cre / lox系统包括Cre重组酶,其识别并结合特定的DNA序列,如loxP位点的。 Cre重组酶的以下的结合,位点特异性重组发生,这会导致去除loxP序列的侧翼序列resultin在随机表达不同的荧光蛋白质的克(的机理如下所述)。各种各样的溴系都可以使用(见评论16,18,19)。该溴菌株之间的主要差异包括在包含在磁带盒荧光基因的数目(一)的差异,从2(溴2.0),3(Br1.0)至4(Br1.1,Br2.1)荧光基因,(ⅱ)的往复取向lox位点的存在,以允许基因反转(Br2.0-2.1),用来lox位点的(ⅲ)(ⅳ)之前的表达或荧光的基因表达沉默的Cre激活的类型,和。最近设立BR3提供了神经元的多色成像的改进方法。一个此转录物的主要特征是,它含有一组新的耐光法呢荧光蛋白,这使均匀染色的最好的神经元的处理20。
重要的是,不同的版本溴盒可含有神经元特异性Thy1肾炎公关omoter或遍在表达CAG病毒(CMV)启动子。最后,虽然一些溴转基因小鼠可以包含单个溴转基因,其他人可能由多个转基因拷贝,由此允许生产的颜色组合的可能性的巨大数目被表达每个小区中(例如参见16)。
在我们的研究中,我们使用R26R,五彩纸屑鼠标包含溴2.1 盒 21。 Br2.1的独特设计允许的Cre介导的DNA倒位和由于loxP位点(图1)的倒数取向不仅删剪。因此,这些反转/切除事件,从而导致颜色变化可以继续下去,只要酶Cre存在16。出于这个原因,可诱导的颞Cre的表达系统是用于使用Br2.1可靠细胞跟踪必不可少。 如图。 1,Br2.1包含一个无处不在的CAG启动之后loxP的两侧新霉素抗性-casseTTE,其作为转录路障,即后跟4荧光报告基因,编码为绿色(GFP),黄色(YFP),红色(RFP)和青色(CFP)荧光蛋白,定位在2串联物。之前Cre重组酶激活没有荧光表达。感应Cre重组酶的使除去新-R的带盒使随机表达的4荧光蛋白之一的在给定的细胞。第一段含有loxP的侧翼GFP和一个颠倒YFP,而第二个段包含loxP的侧翼RFP和一个颠倒的CFP。这些DNA区段可以连续反转(使用loxP位即以相反的方向),或切出,只要Cre重组酶的存在。因此,一过性和受控的Cre转基因应该被使用。该Br2.1磁带提供了一个很好的系统,在信号的位置重叠的排放量区分:YFP的表达,RFP是细胞质,绿色荧光蛋白是核和CFP绑定到细胞膜。 GFP和RFP排放通过常规荧光显微镜容易地分离。为了分离YFP / GFP / CFP排放,需要一种光谱共焦成像系统。总而言之,Br2.1盒允许在每个靶细胞之一的四个不同的荧光基因随机的,可诱导的,和组织特异性表达。实际上,当需要的颜色组合的数量较多,可以产生含有2个等位基因Br2.1的纯合小鼠中,从而导致在2色标记为每个小区中的表达,以及在提高可能的颜色组合的数量,以10 22,部分溴小鼠品系的启用的更大数目的可能的颜色组合的表达,因为带盒的多个拷贝被整合到其基因组16。然而,在大多数情况下,由单个Br2.1等位基因提供四种颜色的组合是足够的。以下在此提供的协议,可以使用SPECTR的一个相对简单的设置建立此方法人用显微镜检查,如果一点任何需要进行校准。
在这里,我们提供了一个适应性强的协议为使用包含单个Br2.1等位基因R26R-五彩纸屑小鼠,对角膜上皮谱系追踪实验。这种转基因小鼠品系已被用于研究结肠21,23和角膜上皮干细胞22,24的起源和命运,干细胞活性的肠癌症25的存在,并且用于在局灶节段性肾小球硬化表征肾足细胞(FSGS) 17。
谱系追踪试验已进行了许多年。最近的技术改进和五彩纸屑小鼠品系的出现,开辟了新的途径进行研究。今天,研究人员可以受益于大量的可商购的组织特异性的Cre线,敲除小鼠和转基因小鼠。这为解决基本的专业知识的科学问题,避免了艰苦的练习设计多功能实验系统的机会,同时提供强大而可靠的数据。
R26R-五彩纸屑小鼠是一种优雅的工具,高效跟踪和研究细胞的性质和行为在活生物体。该系统是容易建立,它允许单细胞的非侵入性的谱系追踪胚胎发生过程中,干细胞再生下稳态,或在不同情况下,如损伤,炎症和癌症。可获得的数据提供了一个强大的不伦不类离子靶细胞,克隆细胞扩张和细胞迁移的生存,以计量的方式的。一个关键步骤是选择合适的基因小鼠品系,可以可靠地在精确的发育阶段允许高效率的组织特异性标记。这个系统的一个限制是,用于监测活生物体,组织必须是可访问和透明的。同样地,内活体动物跟踪一个厚的组织可以仅通过双光子或多光子显微镜促进。然而,细胞追踪有可能在事后组织切片,也许之后它已经转型成为透明的CLARITY方法32,33完整的组织可能会进行研究。另一个限制要考虑的是,虽然邻近的细胞表达同样的荧光团可能属于相同的无性系,它也有可能是它们可以从独立细胞来源可随机表达了相同的荧光基因衍生。这possibili使用多溴等位基因时,让无数的色彩组合TY变得不太可能。
在未来,结合五彩纸屑系统具有可用遗传工具(即敲除,敲入和转基因小鼠模型)将允许基因及其在健康和病理学突变的研究。同样,谱系下不同系统的扰动(即,干细胞小生境的破坏,激光介导的细胞消融,药物治疗)追踪将带来新的见解上的信令在细胞命运决定途径的参与。最终,组合使用荧光和生物发光标记,信号通路和尖端显微镜的遗传记者会为研究人员提供一个强大的系统,了解细胞如何单独到其周围的母语环境做出反应。
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |