ميكروفلويديك تدفق الدوائر عن طريق الدم تم اعادة تشكيل لنموذج الإرقاء وصفائح الدم نقل<em> في المختبر</em
Summary
Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Abstract
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Introduction
الارقاء يتطلب النشاط المشترك والمنظم للخلايا وبروتينات وأيونات والأنسجة في سياق الزمانية المكانية محدود 1. النشاط غير المنضبط قد يؤدي إلى نزيف أو تجلط الدم واعتلال أو وفيات في مجموعة من الاضطرابات المتعلقة تخثر الدم. والموائع الدقيقة تجربة غرفة التدفق هي تقنية الصعبة التي يحاكي الارقاء في المختبر. هذا النهج يتيح التحقيق للتفاعل معقدة من العمليات التي تشارك في الارقاء مع الدور القيادي للالصفائح الدموية.
بعد إصابة الأوعية الدموية والصفائح الدموية تلتصق البروتينات يتعرض مصفوفة تحت البطانة (غليكو) لمنع فقدان الدم. وبعد التصاق، الصفائح الدموية تنشط ومجموع ردا على صناعة السيارات وإشارات نظير الصماوي الأمر الذي يؤدي في النهاية إلى تشكيل شبكة الصفائح الدموية، استقرت الفيبرين ومما أدى إلى شركة، جرح ختم خثرة 2. وخلافا لمعظم غيرها من اختبارات وظائف الصفائح الدموية، من experiالإدلاء بالبيانات مع الدوائر تدفق تأخذ بعين الاعتبار المعلمة المادية من تدفق الدم وبالتالي تأثير الريولوجيا على الخلايا والجزيئات الحيوية 3،4 المشاركة.
وقد ولدت التجارب غرفة تدفق الأفكار بارزة في الارقاء وتجلط الدم عن طريق المعايير الأساسية التي تؤثر على وقف نزيف الدم (الفرعية) العمليات بما في ذلك مصفوفة لاصقة، الريولوجيا وتدفق ملامح، وتكوين الخلايا، ووجود السموم والمخدرات، والقوة الأيونية وغيرها الكثير متفاوتة. في العقدين الماضيين، وانخفاض الإنتاجية التجارب غرفة التدفق تتطلب كميات عينة كبيرة (10-100 مل) تطورت إلى غرف الموائع الدقيقة غالبا ما تتكون من غرف موازية لوحة صغيرة ودمج التكنولوجيا الحديثة لperfusing الدم الكامل في الظروف جدار القص تسيطر 5. Microscaling زادت بشكل ملحوظ فحص الإنتاجية لأن معظمهم من إعداد الجهاز ومبسطة ومطلوب أقل (الدم) حجم، مما يجعل تجربة أكثر سهولة وversatiجنيه. على سبيل المثال، والدم من الحيوانات المختبرية الصغيرة يمكن الآن أن تستخدم من دون الحاجة للتضحية الحيوانات. وهكذا ساعد عينات الدم من الفئران المعدلة وراثيا في تحديد الجزيئات الأساسية تعزيز أو إعاقة الارقاء والأفكار الأساسية رواية 6.
مختبرات الأبحاث المتخصصة في كثير من الأحيان لا تزال تستخدم غرف تدفق العرف على سبيل المثال من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) 7 أن يبلمر على القوالب مطبوعة بالحجر والتي يمكن صورت من قبل البرامج. غرفة الناتجة غير مكلفة، يمكن التخلص منها، ويمكن تفكيكها بسهولة عن التحليل اللاحق. وعلاوة على ذلك، في الأساس أي تصميم السفن، بما في ذلك التشعبات أو المنعطفات الحادة يمكن أن يبنى على الأوامر. هذه الميزة هي أيضا الجانب السلبي له منذ كان توحيد بالفعل المشكلة الرئيسية مع التجارب غرفة التدفق، وPDMS العرف وغرف لا ساعد هذا. على رأس هذه المسألة بالذات، طلاء (الشروط)، تحقيقات الفلورسنت، تخثر، درجة الحرارةerature والوقت بين أخذ العينات وتحليلها كلها سيئة موحدة 8. توحيد هذه المتغيرات هو أمر صعب، ولكن مع ذلك حاجة للسماح مقارنة النتائج بين المختبرات. هذا الموضوع هو الموضوع الرئيسي للجمعية الدولية على تجلط الدم وتخثر الدم في اللجنة الفرعية العلمية والتقييس على الجريانيات الأحيائية 9،10.
يتم نقل مركزات الصفائح الدموية (PC) في المرضى الذين يعانون من مختلف الأمراض التي تسبب نقص الصفيحات الدموية و / أو النزيف. لكن الصفائح الدموية في الكمبيوتر ومن المعروف أن توعي، وخاصة في وظيفة من الوقت تخزين 11، تدهور العملية مرتبطة الشيخوخة ويشار إلى آفة تخزين الصفائح الدموية. ويقال أحيانا أن هذه الصفائح استعادة المتداولة مرة واحدة المنقول 12، ولكن الدليل على ذلك هو ندرة. وعلاوة على ذلك، لا يتم اختبار وظائف الصفائح الدموية التي تشكل جهاز كمبيوتر بشكل روتيني وذلك لأن العلاقة بين هذه المقايسات وفعالية علاجية أو وقائية غير واضح 13. غرف تدفق الموائع الدقيقة توفر وسيلة لتحقيق وظائف الصفائح الدموية في جهاز الكمبيوتر لتحسين سلسلة من المناورات بين جمع وإصدار. وإنما هي أداة بحث قوية ل(الاقتران) مقارنات مباشرة من جهاز الكمبيوتر كما نشرنا سابقا 14،15 ويوصف هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ميكروفلويديك التجارب غرفة التدفق هي أداة ممتازة لتحقيق وظائف الصفائح الدموية في الدم المتدفقة وتستخدم لتقييم الارقاء في المختبر في سياقات تجريبية. وعلى الرغم من ضعف التوحيد بين المختبرات 9، علينا أن نبرهن على داخل المختبر لدينا تباين التجريبية غير مقبول….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers – a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
