Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em> In Vitro</em
Summary
Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Abstract
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Introduction
Hemostasis requiere la actividad combinada y regulada de células, proteínas, iones y tejidos en un contexto espacio-temporal restringida 1. actividad no controlada puede conducir a hemorragia o trombosis y la morbilidad o la mortalidad en un espectro de trastornos relacionados con la coagulación de la sangre. Un experimento de la cámara de flujo de microfluidos es una técnica difícil que imita hemostasis in vitro. Este enfoque permite la investigación de la compleja interacción de procesos que intervienen en la hemostasia con el protagonismo de las plaquetas sanguíneas.
Después de una lesión vascular, las plaquetas se adhieren a las proteínas de la matriz subendotelial expuesta (glico) para prevenir la pérdida de sangre. Después de la adhesión, las plaquetas se activan y el agregado en respuesta a auto- y señalización paracrina que finalmente conduce a la formación de una red de plaquetas, fibrina y estabilizada por lo que resulta en una firma, la herida trombo 2 de sellado. A diferencia de la mayoría de las otras pruebas de la función plaquetaria, expetos con cámaras de flujo tienen en cuenta el parámetro físico del flujo sanguíneo y por lo tanto la influencia de la reología en las células y biomoléculas 3,4 participantes.
experimentos en cámara de flujo han proporcionado multitud de datos de la señal en la hemostasia y la trombosis mediante la variación de los parámetros clave que influyen hemostático (sub) procesos, incluyendo los perfiles de matriz adhesiva, reología y de flujo, composición celular, presencia de toxinas o drogas, fuerza iónica y muchos más. En las últimas dos décadas, experimentos con la cámara de flujo bajo rendimiento que requieren grandes volúmenes de muestra (10-100 ml) se han desarrollado para cámaras de microfluidos menudo consisten en pequeñas cámaras de placas paralelas y que incluyen la tecnología moderna para la perfusión de sangre total en condiciones controladas muro de corte 5. Microscaling ha aumentado significativamente el rendimiento de ensayo sobre todo porque la instalación del hardware ha simplificado y se requiere menos volumen (sangre), lo que hace el experimento más accesible y VersatiLe. Por ejemplo, la sangre de los animales pequeños de laboratorio ahora puede ser utilizado sin la necesidad de sacrificar los animales. De este modo muestras de sangre de ratones modificados genéticamente han ayudado en la identificación de moléculas clave promover o inhibir la hemostasis y en nuevos conocimientos básicos 6.
Laboratorios de investigación especializados a menudo todavía utilizan cámaras de flujo a la medida, por ejemplo de polidimetilsiloxano (PDMS) 7 que polimeriza en moldes litografiado que puede ser blueprinted por software. La cámara resultante es barato, desechable y se puede desmontar fácilmente para el análisis post hoc. Por otra parte, básicamente cualquier diseño de embarcaciones, incluyendo las bifurcaciones o giros bruscos se puede construir en el comando. Esta ventaja es también su lado negativo porque su normalización ya era el principal problema con experimentos en cámara de flujo, y PDMS encargo cámaras no han ayudado esto. En la parte superior de este tema en particular, recubrimiento (condiciones), sondas fluorescentes, anticoagulante, tempratura y el tiempo entre el muestreo y análisis están mal estandarizados 8. La estandarización de estas variables es un reto, pero no obstante necesario para permitir la comparación de resultados entre laboratorios. Este tema es el tema principal de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia en subcomité científico y Normalización en Biorheology 9,10.
Los concentrados de plaquetas (PC) se transfunden en pacientes que sufren de diversas enfermedades que causan trombocitopenia y / o sangrado. Pero plaquetas en PC son conocidos para desensibilizar, especialmente en función del tiempo de almacenamiento 11, un proceso de deterioro relacionado con el envejecimiento y comúnmente conocida como lesión de almacenamiento de plaquetas. A veces se afirma que tales plaquetas restaurar en circulación una vez transfundida 12, pero la evidencia de esto es escasa. Además, la funcionalidad de las plaquetas que forman un PC no se prueba de forma rutinaria debido a que la relación entre tales ensayos yla eficacia terapéutica o profiláctica está claro 13. cámaras de flujo de microfluidos ofrecen un medio para investigar la función plaquetaria en PC para optimizar la cadena de manipulaciones entre la recogida y entrega. Es una poderosa herramienta de investigación para las comparaciones directas (pares) de PC como hemos previamente publicados 14,15 y se describe aquí.
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimentos en cámara de flujo de microfluidos son una excelente herramienta para investigar la función de las plaquetas en la sangre que fluye y se utilizan para evaluar la hemostasia in vitro en diversos contextos experimentales. A pesar de su falta de estandarización entre laboratorios 9, se demuestra que dentro de nuestro laboratorio de la variación experimental es aceptable. Esto permite comparar de forma fiable muestras pareadas () dentro de un determinado estudio. Este fue validado usando…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
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