Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em> In Vitro</em
Summary
Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Abstract
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Introduction
Emostasi richiede l'attività combinata e regolata di cellule, proteine, ioni e tessuti in un contesto spazio-temporale limitato 1. Attività incontrollata può portare a emorragia o trombosi e morbilità o mortalità in uno spettro di disturbi legati alla coagulazione del sangue. Un esperimento camera di flusso microfluidica è una tecnica impegnativa che imita emostasi in vitro. Questo approccio permette di indagine della complessa interazione di processi che prendono parte a emostasi con un ruolo di primo piano per le piastrine del sangue.
A seguito di danno vascolare, le piastrine aderiscono alle proteine della matrice sottoendoteliale esposto (glico) per prevenire la perdita di sangue. Dopo l'adesione, piastrine attivano e aggregate in risposta automatiche e segnalazione paracrina che alla fine porta alla formazione di una rete di piastrine, stabilizzata da fibrina e conseguente fermo, avvolti trombo 2 sigillatura. A differenza di molti altri test di funzionalità piastrinica, rienzementi con camere di flusso tengono conto del parametro fisico del flusso sanguigno e quindi l'influenza della reologia sulle cellule e biomolecole 3,4 partecipanti.
esperimenti camera di flusso hanno generato intuizioni punto di riferimento in emostasi e trombosi variando i parametri chiave che influenzano emostatico (sub) processi tra cui i profili matrice adesiva, reologia e di flusso, composizione cellulare, la presenza di tossine o farmaci, forza ionica e molti altri. Negli ultimi due decenni, bassa produttività esperimenti camera di flusso che richiedono grandi volumi di campione (10-100 ml) si sono evoluti per camere di microfluidica spesso costituite da piccole camere a piatti paralleli e tra le moderne tecnologie per la perfusione di sangue intero in condizioni di parete di taglio a controllo 5. Microscaling ha notevolmente aumentato il throughput test soprattutto perché la configurazione hardware è semplificato ed è richiesto meno (del sangue) del volume, rendendo l'esperimento più accessibile e versatiLe. Per esempio, il sangue da piccoli animali da laboratorio può ora essere utilizzato senza dover sacrificare animali. I campioni di sangue di topi geneticamente modificati hanno quindi aiutato l'identificazione di molecole chiave che promuovono o inibiscono emostasi e in nuove intuizioni fondamentali 6.
Laboratori di ricerca specializzati spesso usano ancora camere a flusso su misura, ad esempio, da polidimetilsilossano (PDMS) 7 che polimerizza su stampi litografate che può essere blueprinted da un software. La camera risultante è poco costoso, monouso e può essere facilmente smontato per l'analisi post hoc. Inoltre, in pratica qualsiasi progettazione di navi, comprese le biforcazioni o curve strette può essere costruito su comando. Questo vantaggio è anche il suo lato negativo in quanto la standardizzazione era già il problema principale con gli esperimenti camera di flusso, e PDMS su misura le camere non hanno aiutato questo. In cima a questa particolare questione, rivestimento (condizioni), sonde fluorescenti, anticoagulante, temperaturaeratura e ora tra il campionamento e l'analisi sono tutti poco standardizzati 8. La standardizzazione di queste variabili è impegnativo, ma comunque atti a consentire un confronto dei risultati tra laboratori. Questo argomento è il principale soggetto della Società Internazionale sulla Trombosi e Emostasi in sottocomitato scientifico e standardizzazione su Biorheology 9,10.
concentrati piastrinici (PC) sono trasfusi in pazienti affetti da varie malattie che causano trombocitopenia e / o sanguinamento. Ma piastrine in PC sono noti per desensibilizzare, soprattutto in funzione del tempo di memorizzazione 11, un processo di degrado legato all'invecchiamento e comunemente indicato come lesione stoccaggio delle piastrine. A volte si afferma che tali piastrine ripristinare in circolazione una volta trasfuse 12, ma la prova di questo è scarsa. Inoltre, la funzionalità delle piastrine che compongono un PC non è normalmente testato perché il rapporto tra tali analisi eefficacia terapeutica o profilattica non è chiaro 13. camere di flusso microfluidica offrono un mezzo per indagare la funzione piastrinica in PC per ottimizzare la catena di manipolazioni tra raccolta e rilascio. Si tratta di un potente strumento di ricerca per (appaiati) il confronto diretto dei PC, come abbiamo precedentemente pubblicati 14,15 ed è descritto qui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esperimenti camera di flusso microfluidici sono un ottimo strumento per studiare la funzione delle piastrine nel sangue che scorre e sono utilizzate per valutare l'emostasi in vitro in diversi contesti sperimentali. Nonostante scarsa standardizzazione interlaboratorio 9, dimostriamo che all'interno del nostro laboratorio la variazione sperimentale è accettabile. Questo permette di confrontare in modo affidabile campioni (appaiati) all'interno di un determinato studio. Questo è stato con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
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