Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em> In Vitro</em
Summary
Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Abstract
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Introduction
Hemostase vereist de gecombineerde en gereguleerde activiteit van cellen, eiwitten, ionen en weefsels in een beperkte spatiotemporele context 1. Ongecontroleerde activiteit kan leiden tot bloedingen of trombose en morbiditeit of mortaliteit in een spectrum van aandoeningen gerelateerd aan bloedstolling. Een microfluïdische stroom kamer experiment is een uitdagende techniek die hemostase nabootst in vitro. Deze aanpak maakt het mogelijk onderzoek naar de complexe samenspel van processen die deelnemen aan hemostase met een hoofdrol voor bloedplaatjes.
Na vasculair letsel, bloedplaatjes zich aan het blootgelegde subendotheliale matrix (glyco) proteïnen bloedverlies te voorkomen. Na hechting, bloedplaatjes activeren en aggregaat in reactie op auto- en paracriene signalering die uiteindelijk leidt tot de vorming van een bloedplaatjes netwerk gestabiliseerd door fibrine en resulteert in een stevig gewikkelde afdichtende trombus 2. In tegenstelling tot de meeste andere bloedplaatjes functietesten, experimenten met stroomkamers rekening houden met de fysische parameter van de bloedstroom en derhalve de invloed van reologie de deelnemende cellen en biomoleculen 3,4.
Stromingskamer experimenten landmark inzichten in hemostase en trombose gegenereerd door het variëren sleutelparameters die invloed hemostatische (sub) processen inclusief de klevende matrix, reologie en stromingsprofielen, cellulaire samenstelling, aanwezig toxinen of drugs, ionsterkte en veel meer. In de afgelopen twee decennia, lage omzet stroom kamer experimenten die grote steekproef volumes (10-100 ml) hebben zich ontwikkeld tot microfluïdische kamers vaak bestaat uit kleine parallelle plaat kamers en met moderne technologie voor het perfuseren volbloed bij gecontroleerde shear omstandigheden 5. Microscaling is sterk toegenomen test throughput vooral omdat de hardware-installatie is vereenvoudigd en minder (bloed) volume nodig is, waardoor het experiment toegankelijker en Versatile. Bijvoorbeeld kan bloed van kleine proefdieren nu gebruikt worden zonder de noodzaak om dieren te offeren. Bloedmonsters van genetisch gemodificeerde muizen hebben dus geholpen bij de identificatie van de belangrijkste moleculen bevorderen of remmen van hemostase en in de roman van basisinzichten 6.
Onderzoekslaboratoria gespecialiseerde vaak nog gebruik maken van custom made stroom kamers bijvoorbeeld uit polydimethylsiloxaan (PDMS) 7, dat polymeriseert op gelithografeerde mallen die kunnen worden blueprinted door software. De resulterende kamer is goedkoop, wegwerpbaar en kan gemakkelijk worden gedemonteerd voor post hoc analyse. Bovendien, in principe elk ontwerp van schepen, waaronder vertakkingen of scherpe bochten kan worden gebouwd op commando. Dit voordeel is ook een nadeel omdat standaardisatie was al de voornaamste probleem met de stroom kamer experimenten en PDMS maat gemaakt kamers hebben dit niet geholpen. Op de top van deze kwestie, coating (omstandigheden), fluorescerende probes, antistollingsmiddel, temperature en de tijd tussen bemonstering en analyse zijn allemaal slecht gestandaardiseerd 8. Standaardisatie van deze variabelen is een uitdaging, maar toch nodig om de vergelijking van de resultaten tussen laboratoria mogelijk te maken. Dit onderwerp is het belangrijkste onderwerp van de International Society op trombose en Haemostase in wetenschappelijke en standaardisatie subcomité biorheology 9,10.
Bloedplaatjes concentraten (PC) transfusie bij patiënten die lijden aan verschillende ziekten die trombocytopenie en / of bloeden veroorzaken. Maar bloedplaatjes PC is bekend dat ongevoelig, met name in functie van de opslagtijd 11, een verouderingsproces gekoppeld aan veroudering en aangeduid als bloedplaatjes opslag laesie. Er wordt wel eens beweerd dat dergelijke plaatjes te herstellen in omloop eenmaal transfusie 12, maar bewijs hiervoor is schaars. Bovendien wordt de functionaliteit van bloedplaatjes die een PC niet routinematig getest omdat de relatie tussen deze bepalingen entherapeutische of profylactische werkzaamheid onduidelijk 13. Microfluïdische stroom kamers bieden een middel om de functie van de bloedplaatjes in de PC te onderzoeken om de keten van manipulaties tussen inzameling en afgifte te optimaliseren. Het is een krachtige research tool voor directe (gepaarde) een vergelijking van de pc, zoals we eerder hebben gepubliceerd 14,15 en wordt hier beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microfluïdische flow chamber experimenten zijn een uitstekend hulpmiddel om bloedplaatjesfunctie onderzoeken stromend bloed en worden gebruikt om hemostase in vitro evalueren in verschillende experimentele context. Ondanks de slechte interlaboratoriumproef standaardisatie 9, tonen we aan dat in ons laboratorium de experimentele variatie is aanvaardbaar. Hierdoor kan betrouwbaar vergelijken (gepaard) monsters binnen een gegeven onderzoek. Dit werd gevalideerd met goed gedocumenteerde verschijnsel van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers – a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
