Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em> In Vitro</em
Summary
Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Abstract
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Introduction
Hemostasia requer a atividade combinada e regulado de células, proteínas, íons e tecidos em um contexto espaço-temporal restrito 1. actividade não controlada pode conduzir a hemorragia ou trombose e morbidade ou mortalidade num espectro de distúrbios relacionados com a coagulação do sangue. Um experimento de câmara de fluxo microfluídico é uma técnica desafiadora que imita hemostasia in vitro. Esta abordagem permite a investigação da interação complexa de processos que fazem parte de hemostasia com um papel de liderança para as plaquetas do sangue.
A seguir a lesão vascular, as plaquetas aderem às proteínas de matriz subendotelial exposta (glico) para evitar a perda de sangue. Após a adesão, activação e agregação de plaquetas em resposta a auto- e paracrino sinalização que, finalmente, conduz à formação de uma rede de plaquetas, estabilizado por fibrina e resultando num firme, ferida trombo 2 de vedação. Diferentemente da maioria dos outros testes de função plaquetária, experimentos com câmaras de fluxo tomar em consideração o parâmetro físico do fluxo sanguíneo e, portanto, a influência de reologia nas células que participam biomoléculas e 3,4.
experimentos câmara de fluxo geraram conhecimentos marco na hemostasia e trombose variando parâmetros-chave que influenciam hemostático (sub) processos, incluindo os perfis de matriz adesiva, reologia e fluxo, composição celular, presença de toxinas ou drogas, força iônica e muitos mais. Nas últimas duas décadas, o baixo rendimento experimentos câmara de fluxo que exigem grandes volumes de amostras (10-100 ml) evoluíram para câmaras microfluídicos, muitas vezes consistem em câmaras de placas paralelas pequenas e incluindo a tecnologia moderna para perfusão de sangue total em condições de cisalhamento controladas 5. Microscaling aumentou significativamente ensaio de rendimento principalmente porque a configuração de hardware tem simplificado e menos volume (sangue) é necessário, tornando a experiência mais acessível e Versatile. Por exemplo, o sangue a partir de pequenos animais de laboratório pode agora ser utilizado sem a necessidade de sacrificar os animais. As amostras de sangue de ratos geneticamente modificados têm, portanto, auxiliado na identificação de moléculas-chave promover ou inibir a hemostasia e em novos conhecimentos básicos 6.
Laboratórios de pesquisa especializados, muitas vezes ainda usam câmaras de fluxo personalizado feito por exemplo, de polidimetilsiloxano (PDMS) 7, que polimeriza em moldes litografadas que pode ser blueprinted por software. A câmara resultante é barato e descartável e pode ser facilmente desmontado para análise post hoc. Além disso, basicamente, qualquer construção de embarcações, incluindo bifurcações ou curvas fechadas podem ser construídas no comando. Esta vantagem é também a sua desvantagem desde normalização já era o principal problema com experimentos câmara de fluxo, e PDMS personalizado feito câmaras não têm ajudado isso. No topo desta questão em particular, revestimento (condições), sondas fluorescentes, anticoagulante, temperaturaratura e tempo entre a amostragem e análise são todos mal padronizado 8. Padronização dessas variáveis é um desafio, mas, no entanto, necessário para permitir a comparação de resultados entre laboratórios. Este tópico é o assunto principal da Sociedade Internacional sobre Trombose e Hemostasia na subcomissão Científico e Normalização em Biorheology 9,10.
Os concentrados de plaquetas (PC) são transfundidas em pacientes que sofrem de várias doenças que provocam trombocitopenia e / ou sangramento. Mas plaquetas no PC são conhecidos para dessensibilizar, especialmente em função do tempo de armazenamento 11, um processo de deterioração associada ao envelhecimento e vulgarmente referidos como lesão de armazenagem de plaquetas. Às vezes é alegado que essas plaquetas restaurar em circulação, uma vez transfundido 12, mas as evidências para isso é escasso. Além disso, a funcionalidade de plaquetas que formam um PC não é rotineiramente testadas porque a relação entre tais ensaios eeficácia terapêutica ou profilática não está claro 13. câmaras de fluxo microfluídicos oferecem um meio para investigar a função plaquetária no PC para otimizar a cadeia de manipulações entre a recolha ea emissora. É uma ferramenta de pesquisa poderosa para (pareados) comparações diretas de PC como já anteriormente publicados 14,15 e é descrito aqui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimentos câmara de fluxo microfluidicos são uma excelente ferramenta para investigar a função das plaquetas no fluxo sanguíneo e são usados para avaliar a hemostasia in vitro em vários contextos experimentais. Apesar de pobre normalização interlaboratory 9, demonstra-se que dentro do nosso laboratório a variação experimental é aceitável. Isto permite comparar de forma confiável amostras (pareados) dentro de um determinado estudo. Este foi validado utilizando o fenômeno bem d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
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