كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت
Summary
التحقيق في الاتجار بالغشاء أمر بالغ الأهمية لفهم وظائف الخلايا العصبية. هنا، ونحن نقدم طريقة لقياس الحركة الحويصلة في الخلايا العصبية. هذا هو وسيلة مريحة التي يمكن أن تتكيف مع القياس الكمي للاتجار الغشاء في الجهاز العصبي.
Abstract
في الدماغ، نظم الاتجار غشاء تلعب أدوارا هامة في تنظيم وظائف الخلايا العصبية، مثل التشكل العصبية، اللدونة متشابك، والبقاء على قيد الحياة، والاتصالات الدبقية. حتى الآن، وقد ذكرت العديد من الدراسات أن عيوب في هذه النظم تسبب مختلف الأمراض العصبية. وهكذا، فهم الآليات الكامنة وراء ديناميات الحويصلة قد توفر أدلة مؤثرة التي يمكن أن تساعد في علاج العديد من الاضطرابات العصبية. هنا، نحن تصف طريقة لقياس الحركات الحويصلات، مثل المسافة الحركة ومعدل الحركة، وذلك باستخدام برنامج المكونات في لمنصة إيماجيج. للحصول على صور لتقدير الكميات، وصفنا الهياكل العصبية-ليسوسوم الخلايا العصبية مع إغف الموسومة بروتينات حويصلة علامة ولاحظ حركة الحويصلات باستخدام المجهر الفاصل الزمني. هذه الطريقة مفيدة للغاية وتبسيط قياس الحويصلة الحركة في نيوريتس، مثل المحاور العصبية، والتشعبات، وكذلك في سوما من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية على حد سواء. Furthermoإعادة، وهذا الأسلوب يمكن تطبيقها على خطوط الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية. ويمكن أن يوفر هذا النهج تقدما قيما لفهمنا للاتجار بالأغشية.
Introduction
السيطرة الدقيقة على الاتجار إندوسوم-ليسوسوم أمر لا غنى عنه لتنظيم وظيفة الخلايا العصبية. ومن الجدير بالذكر أن الحركات الديناميكية لهذه الحويصلات هي عامل رئيسي في تنظيم التشكل العصبي، والتنمية، والبقاء على قيد الحياة. العيوب في هذا النظام يسبب اضطرابات عصبية شديدة 1 ، 2 . وتعتبر الآليات الجزيئية التي تربط الاتجار بالحويصلة بالأمراض العصبية معقدة، وسعت عدة مجموعات إلى دراسة هذه الأهمية. على سبيل المثال، فقد أفيد أن الحركة المضطربة في نهاية متأخرة يرتبط بشكل كبير مع نيمان بيك C المرض 3 ، وهو اضطراب العصبية الموروثة الناجمة عن عيوب ليسوسوم. مثال آخر هو طفرة في الليسوزومية كا 2 + قناة، تربمل 1، مما يضعف الحركة الليزوزومية، مما أدى إلى أمراض تخزين الليزوزومية 4 ، 5 ، </سوب> 6 . وقد ذكرت مجموعتنا أن التقلبات في بتدينز (3،5) P 2 دوران يلغي إندوسوم و ليسوسوم حركية في الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى زيادة في التعرض للاستجابة الإجهاد 7 ، 8 . تنظيم الأيض من بتدينز (3،5) P 2 ، التي توضع في الغالب على إندوسوميس المتأخرة والليسوسومات، يلعب دورا هاما في مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك الاتجار الحويصلة وعمليات الانصهار الانشطار 9 ، 10 . منذ ضعاف بتدينز (3،5) P 2 دوران يسبب التنكس العصبي الحاد 11 ، 12 ، وتنظيم شاذ من الحركة إندوسوم-ليسوسوم يمكن أن يكون عاملا رئيسيا لفهم التسبب في التنكس العصبي. وبالتالي فإن التحقيق في الآليات الجزيئية التي تكمن وراء حركية الحويصلة قد توفر أدلة واعدة يمكن أن تعمق وندرضوخ العديد من الاضطرابات العصبية.
في هذه الورقة، ونحن نقدم طريقة قيمة لتحديد الحركة الحويصلة في الخلايا العصبية باستخدام حزمة البرمجيات الحرة تسمى دليل تتبع. وكان الهدف هو تطوير طريقة القياس الكمي لتحليل الحركة الحويصلة. يتم توجيه هذا التقدير الكمي من خلال نهج قياسي من النقر على نقطة مرجعية في كل إطار من فيلم الفاصل الزمني. استخدام برنامج التتبع اليدوي يجعل هذا النهج بسيطا جدا ومنفعة واسعة، على عكس التطبيقات الأخرى. وعلاوة على ذلك، هذا النهج ينطبق أيضا على خلايا أخرى، مثل الخلايا الدبقية. على الرغم من أن هذه الطريقة بدائية، فإنه يمكن تطبيقها على التحليلات المختلفة، بما في ذلك الحركة الخلوية والتغيير المورفولوجي. على سبيل المثال، بعد تحديد نقطة مرجعية عبر سلسلة من الصور، يمكن استخراج المعلومات عن مواقف النقاط المرجعية والوقت في كل موقف من الصور المتسلسلة باستخدام تحليل البيانات ومعالجة الصور الناعمةوير. مجتمعة، وهذه الطريقة هي بسيطة ولكنها قوية ويسهم في تطوير كفاءة محسنة في الدراسات التي تقوم على الاتجار الغشائي، مثل تلك التي فحص وظيفة إندوسوم-ليسوسوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يقدم الإجراء لقياس الحركة الحويصلة. في الخلايا العصبية الأولية، إندوسوميس و ليسوسوميس تميل إلى إظهار حركية عالية في الخلايا العصبية الأصغر سنا (4-6 ديف). وبالنظر إلى أن الخلايا العصبية يجب أن تقدم بعض المكونات إلى الحواف الرائدة لاستطالة العمليات العص?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ريكاردو دولميتسش (كلية الطب بجامعة ستانفورد؛ الانتماء الحالي: معاهد نوفارتيس للبحوث الطبية الحيوية) للمساعدة في تطوير هذا التحليل والدكتور ماثيو وود، تاكوما أيهارا، ودونغسوك كيم لقراءتهم النقدية للمخطوطة.
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- . Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017)
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- . Manual Tracking [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual (2017)
- . ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017)
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
