כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי
Summary
החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.
Abstract
במוח, מערכות סחר ממברנה משחקות תפקידים חשובים בוויסות תפקודים עצביים, כגון מורפולוגיה נוירונים, גמישות סינפטית, הישרדות ותקשורת גלייה. עד כה, מחקרים רבים דיווחו כי פגמים במערכות אלה גורמים למחלות עצביות שונות. לפיכך, הבנה של המנגנונים הבסיסיים של הדינמיקה שלפוחית עשוי לספק רמזים משפיעים שיכולים לסייע בטיפול של הפרעות עצביות מספר. כאן, אנו מתארים שיטה לכמת motities שלפוחית, כגון מרחק התנועה ואת קצב התנועה, באמצעות תוכנה plug-in עבור פלטפורמת ImageJ. כדי להשיג תמונות לכימות, אנו שכותרתו מבנים endosome-lysosome נוירונים עם EGFP- מתויג שלפוחית חלבונים סמן נצפתה התנועה של שלפוחית באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות. שיטה זו שימושית מאוד לפשט את תנועת שלפוחיות מדידה neurites, כגון אקסונים ודנדריטים, כמו גם סומה של שני נוירונים ותאי גלייה. מחיר SONYמחדש, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על שורות תאים אחרים, כגון fibroblasts ותאי האנדותל. גישה זו יכולה לספק התקדמות חשובה של ההבנה שלנו של סחר קרום.
Introduction
שליטה מדויקת של סחר endosome-lysosome היא הכרחית לוויסות פונקציה העצבית. יש לציין כי התנועות הדינמיות של שלפוחיות אלה הן גורם מרכזי ביסוד המורפולוגיה הנוירונים, הפיתוח והישרדות. פגמים במערכת זו לגרום להפרעות נוירונים חמורים 1 , 2 . המנגנונים המולקולריים המקשרים בין סרטן שלפוחית למחלות נוירונים נחשבים מסובכים, וכמה קבוצות ביקשו לבחון את הרלוונטיות הזו. לדוגמה, דווח כי תנועה נידחת מאוחר של האינדוזום קשורה באופן משמעותי למחלת נימן-פיק 3 , מחלה תורשתית נוירו-גנטית הנגרמת על ידי פגמים בליזוזום. דוגמה נוספת היא מוטציה של ערוץ Ca 2 + lysosomal , trpml 1, אשר פוגעת בתנועות ליזוזומליות, וכתוצאה מכך למחלות אחסון lysosomal 4 , 5 , </Sup> 6 . הקבוצה שלנו דיווחה כי dysregulation של PtdIns (3,5) P 2 מחזור מדכאת את תנועתיות אנדוסום ו lysosome בנוירונים, מה שמוביל לעלייה פגיעות לתגובה הלחץ 7 , 8 . תקנה מטבולית של PtdIns (3,5) P 2 , אשר בעיקר localizes על endosomes ו lysosomes מאוחר, ממלאת תפקיד חשוב במגוון רחב של פונקציות הסלולר, כולל סחר שלפוחית תהליכי ביקוע היתוך 9 , 10 . מאז פגומה PtdIns (3,5) P 2 מחזור גורם נוירוגנרטיון חמור 11 , 12 , הרגולציה חריגה של תנועתיות אנדוסום- lysosome יכול להיות גורם מפתח להבנת הפתוגנזה של ניוון מוחי. חקירה של המנגנונים המולקולריים המונחים ביסוד תנועתיות שלפוחית עשויה, אם כן, לספק רמזים מבטיחים שיכולים להעמיק את חוסר היכולת שלנושל כמה הפרעות נוירונים.
במאמר זה, אנו מציגים שיטה יקר לכמת תנועתיות שלפוחית נוירונים באמצעות חבילת תוכנה חופשית בשם מעקב ידני. המטרה היתה לפתח שיטת כימות מהירה לנתח את תנועתיות שלפוחית. כימות זה מכוונת דרך גישה סטנדרטית של לחיצה על נקודת התייחסות בכל מסגרת של זמן לשגות הסרט. השימוש בתוכנת המעקב הידני הופך את הגישה הזו לפשוטה למדי ולתועלת רחבה, בניגוד ליישומים אחרים. יתר על כן, גישה זו חלה גם על תאים אחרים, כגון תאי גלייה. למרות ששיטה זו היא פרימיטיבית, ניתן ליישם אותה בניתוחים שונים, כולל תנועתיות סלולרית ושינוי מורפולוגי. לדוגמה, לאחר הגדרת נקודת התייחסות על פני רצף של תמונות, מידע על המיקום של נקודות התייחסות ואת הזמן בכל עמדה ניתן לחלץ מתמונות רציף באמצעות ניתוח נתונים ועיבוד תמונה רכהכלי. יחד, שיטה זו היא פשוטה אך רבת עוצמה ותורמת לפיתוח של יעילות משופרת במחקרים המבוססים על סחר בממברנה, כגון אלה בודקים endosome-lysosome פונקציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג את ההליך לכימות תנועתיות שלפוחית. ב נוירונים ראשוניים, endosomes ו lysosomes נוטים להראות תנועתיות גבוהה אצל נוירונים צעירים יותר (4-6 DIV). בהתחשב בכך נוירונים חייבים לספק כמה רכיבים לקצוות המובילים להאריך תהליכים עצביים, סחר קרום צריכה להתרחש באופן דינמי במהל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר ריקרדו דולמטש (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד, השתייכות נוכחית: מכוני נוברטיס למחקר ביו-רפואי) על סיוע בפיתוח ניתוח זה וד"ר מתיו ווד, טקומה איהארה ודנגסוק קים לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- . Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017)
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- . Manual Tracking [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual (2017)
- . ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017)
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
