Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden
Summary
Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.
Abstract
Im Gehirn spielen Membran-Trafficking-Systeme eine wichtige Rolle bei der Regulierung neuronaler Funktionen wie neuronaler Morphologie, synaptischer Plastizität, Überleben und Glia-Kommunikation. Bisher haben zahlreiche Studien berichtet, dass Defekte in diesen Systemen verschiedene neuronale Erkrankungen verursachen. So kann das Verständnis der Mechanismen, die der Vesikeldynamik zugrunde liegen, einflussreiche Hinweise liefern, die bei der Behandlung von mehreren neuronalen Störungen helfen können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung von Vesikelmotazitäten, wie Motilitätsabstand und Bewegungsgeschwindigkeit, mit einem Software-Plug-In für die ImageJ-Plattform. Um Bilder zur Quantifizierung zu erhalten, markierten wir neuronale Endosom-Lysosomenstrukturen mit EGFP-markierten Vesikelmarkerproteinen und beobachteten die Bewegung von Vesikeln mit einer Zeitraffer-Mikroskopie. Diese Methode ist sehr nützlich und vereinfacht die Messung der Vesikelmotilität in Neuriten wie Axonen und Dendriten sowie im Soma von Neuronen und Gliazellen. WeiterDiese Methode kann auf andere Zelllinien, wie Fibroblasten und Endothelzellen, angewendet werden. Dieser Ansatz könnte einen wertvollen Fortschritt für unser Verständnis des Membranhandels darstellen.
Introduction
Die präzise Kontrolle des Endosom-Lysosomen-Traffickings ist für die Regulierung der neuronalen Funktion unentbehrlich. Bemerkenswerterweise sind die dynamischen Bewegungen dieser Vesikel ein Schlüsselfaktor für die Regulierung der neuronalen Morphologie, der Entwicklung und des Überlebens. Defekte in diesem System verursachen schwere neuronale Störungen 1 , 2 . Die molekularen Mechanismen, die den Vesikelhandel mit neuronalen Erkrankungen verknüpfen, gelten als kompliziert, und mehrere Gruppen haben versucht, diese Relevanz zu untersuchen. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die gestörte späte Endosom-Motilität signifikant mit der Niemann-Pick-C-Krankheit 3 assoziiert ist, einer erblichen neurodegenerativen Störung, die durch Lysosomendefekte verursacht wird. Ein weiteres Beispiel ist eine Mutation in einem lysosomalen Ca 2+ -Kanal, trpml 1, der die lysosomale Motilität beeinträchtigt, was zu lysosomalen Speicherkrankheiten 4 , 5 , </Sup> 6 Unsere Gruppe hat berichtet, dass die Dysregulation des PtdIns (3,5) P 2 Umsatzes die Endosom- und Lysosommotilität in Neuronen unterdrückt, was zu einer Erhöhung der Anfälligkeit gegenüber der Stressreaktion 7 , 8 führt . Die metabolische Regulation von PtdIns (3,5) P 2 , die sich meist auf späten Endosomen und Lysosomen lokalisiert, spielt eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von zellulären Funktionen, darunter Vesikelhandels- und Fusionsspaltungsverfahren 9 , 10 . Da beeinträchtigte PtdIns (3,5) P 2 -Verwender eine schwere Neurodegeneration 11 , 12 verursachen , könnte die abweichende Regulation der Endosom-Lysosom-Motilität ein Schlüsselfaktor für das Verständnis der Pathogenese der Neurodegeneration sein. Eine Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Vesikelmotilität zugrunde liegen, kann so vielversprechende Hinweise liefern, die unsere Ungerechtigkeit vertiefen könnenVerständnis von mehreren neuronalen Störungen.
In dieser Arbeit stellen wir eine wertvolle Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen mit einem kostenlosen Softwarepaket namens Manual Tracking vor. Ziel war es, eine schnelle Quantifizierungsmethode zur Analyse der Vesikelmotilität zu entwickeln. Diese Quantifizierung wird durch einen Standardansatz des Klickens auf einen Referenzpunkt in jedem Rahmen eines Zeitrafferfilms gelenkt. Die Verwendung der manuellen Tracking-Software macht diesen Ansatz im Gegensatz zu anderen Anwendungen ganz einfach und von weitem Nutzen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz auch auf andere Zellen, wie Gliazellen, anwendbar. Obwohl diese Methode primitiv ist, kann sie auf verschiedene Analysen angewendet werden, einschließlich der zellulären Motilität und der morphologischen Veränderung. Beispielsweise können nach der Definition eines Referenzpunktes über eine Sequenz von Bildern Informationen über die Positionen der Referenzpunkte und die Zeit an jeder Position aus sequentiellen Bildern unter Verwendung von Datenanalyse und Bildverarbeitung weich extrahiert werdenWare. Zusammengenommen ist diese Methode einfach, aber leistungsfähig und trägt zur Entwicklung einer verbesserten Effizienz in Studien auf der Grundlage von Membran-Trafficking, wie die untersucht Endosom-Lysosom-Funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll führt die Vorgehensweise zur Quantifizierung der Vesikelmotilität ein. In primären Neuronen, Endosomen und Lysosomen neigen dazu, hohe Motilität in jüngeren Neuronen (4-6 DIV) zu zeigen. Angesichts der Tatsache, dass Neuronen einige Komponenten an die Vorderkanten liefern müssen, um neuronale Prozesse zu verlängern, sollte der Membranhandel in diesem Stadium dynamisch auftreten. So ist es wichtig, jüngere Neuronen zu verwenden, um die dynamische Motilität in neuronalen Dendriten zu beobachten. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, jetzige Zugehörigkeit: Novartis Institute for Biomedical Research) für die Entwicklung dieser Analyse und Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara und Dongsook Kim für ihre kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
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