Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi
Summary
Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir.
Abstract
Beyinde, zar ticaret sistemi, nöronal morfoloji, sinaptik esneklik, hayatta kalma ve glial iletişim gibi nöronal fonksiyonların düzenlenmesinde önemli roller oynar. Bugüne kadar çok sayıda çalışma, bu sistemlerin kusurlarının çeşitli nöronal hastalıklara neden olduğunu bildirmiştir. Böylece vezikül dinamiklerinin altında yatan mekanizmaları anlamak, çeşitli nöronal bozuklukların tedavisinde yardımcı olabilecek etkili ipuçları sağlayabilir. Burada, hareket noktası mesafesi ve hareket hızı gibi vezikül hareketlerini ImageJ platformu için bir yazılım eklentisi kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Niceleme için görüntü elde etmek için, EGFP ile etiketlenmiş vezikül işaretleyici proteinleri olan nöronal endozom-lizozom yapılarını etiketledik ve veziküllerin bir zaman atlamalı mikroskobi ile hareketi gözlemledik. Bu yöntem son derece yararlıdır ve aksonlar ve dendritler gibi nöritlerin ve hem nöronların hem de glial hücrelerin soma'sındaki vezikül hareketliliğinin ölçülmesini basitleştirir. FurthermoYeniden, bu yöntem fibroblastlar ve endotel hücreleri gibi diğer hücre hatlarına da uygulanabilir. Bu yaklaşım, zar ticareti anlayışımızı değerli bir ilerleme sağlayabilir.
Introduction
Endozom-lizozom ticaretinin hassas kontrolü, nöronal fonksiyonu düzenlemek için vazgeçilmezdir. Özellikle, bu veziküllerin dinamik hareketi, nöronal morfolojinin, gelişimin ve hayatta kalmanın düzenlenmesinde temel faktördür. Bu sistemdeki kusurlar ciddi nöronal bozukluklara neden olur 1 , 2 . Vezikül ticaretini nöronal hastalıklarla ilişkilendiren moleküler mekanizmalar karmaşık kabul edilir ve birçok grup bu önemi incelemeye çalıştı. Örneğin, tedirgin geç endozom motilitesinin, lizozom defektlerinin yol açtığı kalıtsal bir nörodejeneratif bozukluk olan Niemann-Pick C hastalığı 3 ile önemli derecede ilişkili olduğu bildirilmiştir. Başka bir örnek, lizozomal Ca 2+ kanalındaki trpml 1'deki mutasyon olup, lizozomal hareketliliği bozarak lizozomal depolama hastalıkları 4 , 5 , </Sup> 6 . Grubumuz PtdIns'in (3,5) P 2 devresinin düzenlenmesinin nöronlarda endozom ve lizozom motilitesini baskıladığını ve bunun da stres tepkisine karşı savunmasızlıktan 7 , 8 arttığını bildirmiştir. Çoğunlukla geç endozomlar ve lizozomlarda lokalize olan PtdIns (3,5) P2'nin metabolik düzenlenmesi, vezikül ticareti ve füzyon-fisyon işlemleri gibi çok çeşitli hücresel işlevlerde önemli bir rol oynamaktadır 9,10. Zayıflamış PtdIns (3,5) P 2 ciro şiddetli nörodejenerasyon 11,12'ye neden olduğu için, endozom-lizozom motilitesinin sapması regülasyonu, nörodejenerasyon patogenezini anlamak için önemli bir faktör olabilir. Vesikül hareketliliğinin altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılması, bu nedenle, bizim vefizimizi derinleştiren umut verici ipuçları sağlayabilirBirkaç nöronal rahatsızlığın kavranması.
Bu yazıda, Manuel İzleme adlı özgür yazılım paketini kullanarak nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için değerli bir yöntem sunuyoruz. Amaç, vezikül hareketliliğini analiz etmek için hızlı bir kantifikasyon yöntemi geliştirmekti. Bu niceleme, zaman atlamalı filmin her karesinde bir referans noktasına tıklayarak standart bir yaklaşımla yönlendirilir. Manuel İzleme yazılımının kullanılması, bu yaklaşımı diğer uygulamalardan farklı olarak oldukça basit ve geniş yarar sağlar. Dahası, bu yaklaşım glial hücreler gibi diğer hücrelere de uygulanabilir. Bu yöntem ilkel olmasına rağmen, hücresel motilite ve morfolojik değişim de dahil olmak üzere çeşitli analizlere uygulanabilir. Örneğin, bir görüntü dizisi boyunca bir referans noktası tanımladıktan sonra, referans noktalarının konumları ve her bir konumdaki zamana ilişkin bilgiler, veri analizi ve görüntü işleme yumuşaklığı kullanılarak ardışık görüntülerden çıkarılabilirmaldır. Birlikte ele alındığında, bu yöntem basit ama güçlüdür ve endosome-lizozom fonksiyonunu inceleyenler gibi membran ticaretine dayalı çalışmaların geliştirilmiş etkinliğinin geliştirilmesine katkıda bulunur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol vezikül hareketliliğini ölçmek için prosedür tanıtır. Primer nöronlarda, endozomlar ve lizozomlar, genç nöronlarda yüksek motilite gösterme eğilimindedir (4-6 DIV). Sinirsel süreçleri uzatmak için nöronların öncü kısımlara bazı bileşenler vermesi gerektiği göz önüne alındığında, bu aşamada zar ticareti dinamik bir şekilde gerçekleşmelidir. Bu nedenle, genç nöronları nöronal dendritlerde dinamik motilite gözlemlemek için kullanmak önemlidir. Buna ek olarak, daha bü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu analizin geliştirilmesine yardımcı olduğumuz Dr. Ricardo Dolmetsch'e (Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi, bugünkü üyelik: Novartis Biyomedikal Araştırmalar Enstitüsü) ve makalenin eleştirel okumalarından dolayı Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara ve Dongsook Kim'e teşekkür ediyoruz.
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- . Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017)
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- . Manual Tracking [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual (2017)
- . ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017)
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
