형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화
Summary
막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.
Abstract
뇌에서 멤브레인 트래 피킹 시스템은 연결 형태, 시냅스 가소성, 생존 및 신경 교종과 같은 신경 기능을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 지금까지 수많은 연구에서 이러한 시스템의 결함이 다양한 신경 질환을 일으킨다 고보고했습니다. 따라서, 소포 역학의 기저를 이해하는 메커니즘은 여러 가지 신경 질환의 치료에 도움이 될 수있는 영향력있는 단서를 제공 할 수 있습니다. 여기에서는 ImageJ 플랫폼 용 소프트웨어 플러그인을 사용하여 운동 거리 및 이동 속도와 같은 소포 운동을 정량화하는 방법을 설명합니다. 정량화를위한 이미지를 얻기 위해, 우리는 EGFP – 태그 소낭 마커 단백질과 연결 endosome – 리소좀 구조를 표시하고 시간 경과 현미경을 사용하여 소포의 움직임을 관찰했다. 이 방법은 매우 유용하고 축삭 및 수상 돌기와 같은 신경 돌기뿐만 아니라 뉴런 및 신경아 교세포의 소마에서 소포 운동성 측정을 단순화합니다. 추가이 방법은 섬유 아세포 및 내피 세포와 같은 다른 세포주에도 적용될 수있다. 이 접근법은 막 밀매에 대한 우리의 이해를 진전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
Endosome-lysosome trafficking의 정확한 조절은 신경 기능 조절에 필수 불가결합니다. 주목할 만하게,이 vesicles의 동적 인 운동은 신경질 형태학, 발달 및 생존의 규칙의 기초가되는 중요한 요인이다. 이 시스템의 결함은 심한 신경 장애를 유발합니다 1 , 2 . 소포 인신 매매를 신경 질환과 연결시키는 분자 메커니즘은 복잡하다고 여겨지며, 몇몇 그룹에서는이 관련성을 조사하려고 시도해 왔습니다. 예를 들어, 늦은 엔도 솜 운동성을 교란 시키면 리소좀 결함으로 인해 유전되는 신경 퇴행성 질환 인 Niemann-Pick C 질병 3 과 유의 한 연관성이있는 것으로보고되었습니다. 다른 예는 리소좀 운동성을 손상시키는 리소좀 성 Ca 2+ 채널 trpml 1의 돌연변이로 리소좀 성 저장 질환 4 , 5 , </6 . 우리 그룹은 PtdIns (3,5) P 2 turnover의 조절 장애가 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 운동성을 억제하여 스트레스 반응에 대한 취약성이 증가한다고보고했다. PtdIns (3,5) P 2의 대사 조절은 후기 엔도 좀과 리소좀에 주로 국한되며, 소포 수송과 융합 분열 과정을 포함한 다양한 세포 기능에 중요한 역할을한다. 손상된 PtdIns (3,5) P 2 turnover가 심한 신경 퇴화를 유발하기 때문에 11,12 endosome-lysosome 운동성의 비정상적인 조절은 신경 퇴행의 발병 기전을 이해하는 중요한 요소가 될 수 있습니다. 소포 운동성의 기초가되는 분자 메커니즘에 대한 연구는 우리의 unde를 깊게 할 수있는 유망한 단서를 제공 할 수 있습니다몇 가지 신경 장애의 견해.
이 논문에서는 수동 추적이라는 무료 소프트웨어 패키지를 사용하여 뉴런의 소포 운동성을 정량화하는 유용한 방법을 소개합니다. 목표는 소포 운동성을 분석하는 빠른 정량화 방법을 개발하는 것이 었습니다. 이 양화는 저속 영화의 각 프레임에서 기준점을 클릭하는 표준 방식을 통해 이루어집니다. 수동 추적 소프트웨어를 사용하면이 방법을 다른 응용 프로그램과 달리 매우 간단하고 폭넓게 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 접근법은 신경 교세포와 같은 다른 세포에도 적용 가능하다. 이 방법은 원시적이지만 세포 운동성 및 형태 학적 변화를 비롯한 다양한 분석에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어 일련의 이미지에서 참조 점을 정의한 후 데이터 분석 및 이미지 처리 소프트를 사용하여 순차 이미지에서 참조 지점의 위치 및 각 위치에서의 시간에 대한 정보를 추출 할 수 있습니다제품. 이 방법은 간단하면서도 강력하며, 엔도 좀 – 리소좀 기능을 검사하는 것과 같은 멤브레인 트래 피킹을 기반으로 한 연구의 효율성 향상에 기여합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 소포 운동성을 정량화하는 절차를 소개합니다. 일차 뉴런에서 엔도 좀과 리소좀은 젊은 뉴런에서 높은 운동성을 나타내는 경향이 있습니다 (4-6 DIV). 뉴런은 신경 프로세스를 길게하기 위해 리딩 에지에 몇 가지 구성 요소를 제공해야한다는 것을 감안할 때 멤브레인 트래 피킹은이 단계에서 동적으로 발생해야합니다. 따라서, 신경 dendrites의 동적 운동을 관찰하기 위해 젊은 뉴런을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이번 분석을 돕기 위해 Ricardo Dolmetsch 박사 (Stanford University of Medicine, 현재 : Novartis Institute for Biomedical Research)와 Matthew Wood 박사, Aihara Takum, Dongsook Kim에게 감사드립니다.
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
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