Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

Summary

L'indagine sul traffico di membrana è fondamentale per la comprensione delle funzioni neuronali. Qui introduciamo un metodo per quantificare la motilità della vescicola nei neuroni. Questo è un metodo conveniente che può essere adattato alla quantificazione del traffico di membrana nel sistema nervoso.

Abstract

Nel cervello, i sistemi di traffico di membrana svolgono un ruolo importante nella regolazione delle funzioni neuronali, come la morfologia neuronale, la plasticità sinaptica, la sopravvivenza e le comunicazioni gliali. Ad oggi, numerosi studi hanno riportato che i difetti di questi sistemi causano varie malattie neuronali. Quindi, la comprensione dei meccanismi sottostanti alla dinamica delle vescicole può fornire indizi influenti che potrebbero aiutare nel trattamento di diversi disturbi neuronali. Qui descriviamo un metodo per quantificare le motilità delle vescicole, come la distanza della motilità e il tasso di movimento, utilizzando un plug-in software per la piattaforma ImageJ. Per ottenere immagini per la quantificazione, abbiamo etichettato strutture endosomi-lisosomi neuronali con proteine ​​del marker di vescicola tagged EGFP e osservato il movimento delle vescicole usando una microscopia a tempo trascorso. Questo metodo è estremamente utile e semplifica la misurazione della motilità della vescicola nei neuriti, come assoni e dendriti, così come nel soma di entrambi i neuroni e le cellule gliali. FurthermoQuesto metodo può essere applicato ad altre linee cellulari, come i fibroblasti e le cellule endoteliali. Questo approccio potrebbe fornire un prezioso avanzamento della nostra comprensione del traffico di membrana.

Introduction

Il controllo preciso del traffico endosomi-lisosomi è indispensabile per la regolazione della funzione neuronale. In particolare, i movimenti dinamici di queste vescicole sono un fattore chiave alla base della regolazione morfologica, dello sviluppo e della sopravvivenza neuronale. I difetti in questo sistema causano gravi disordini neuronali ^{1 , 2} . I meccanismi molecolari che collegano il traffico di vescicole alle malattie neuronali sono considerate complicate e diversi gruppi hanno cercato di esaminare questa rilevanza. Ad esempio, è stato riportato che la motilità endoteliale tardiva perturbed è significativamente associata alla malattia di Niemann-Pick C ³ , un disordine neurodegenerativo ereditato causato da difetti lisosomi. Un altro esempio è una mutazione in un canale lizosomico Ca ²⁺ , trpml 1, che danneggia la motilità lisosomica, con conseguente malattia di stoccaggio lisosomiale ^{4 , 5 ,} </Sup> ⁶ . Il nostro gruppo ha riferito che la disregolazione del turnover di PtdIns (3,5) P ₂ elimina la motilità endosoma e lisosomica nei neuroni, portando ad un aumento della vulnerabilità alla risposta allo stress ^{7 , 8} . La regolazione metabolica di PtdIns (3,5) P ₂ , che localizza principalmente in endosomi tardivi e lisosomi, svolge un ruolo importante in un'ampia varietà di funzioni cellulari, tra cui la trattazione di vescicole e processi di fusione-fissione ^{9 , 10} . Poiché la perdita di turnover PtdIns (3,5) P ₂ causa una grave neurodegenerazione ^{11 , 12} , la regolazione aberrante della motilità endosoma-lisosomica potrebbe essere un fattore chiave per comprendere la patogenesi della neurodegenerazione. Un'analisi dei meccanismi molecolari che sottostanno la motilità della vescicola possono quindi fornire suggerimenti promettenti che possono approfondire la nostra undeDi diversi disturbi neuronali.

In questo articolo introdurremo un metodo prezioso per quantificare la motilità delle vescicole nei neuroni usando un pacchetto software libero chiamato Tracking manuale. Lo scopo era sviluppare un metodo di quantificazione rapida per analizzare la motilità della vescicola. Questa quantificazione è diretta attraverso un approccio standard di clic su un punto di riferimento in ogni fotogramma di un film a tempo trascorso. L'utilizzo del software di monitoraggio manuale rende questo approccio molto semplice e di grande utilità, a differenza di altre applicazioni. Inoltre, questo approccio è applicabile anche ad altre cellule, come le cellule gliali. Anche se questo metodo è primitivo, può essere applicato a varie analisi, tra cui la motilità cellulare e il cambiamento morfologico. Ad esempio, dopo aver definito un punto di riferimento in una sequenza di immagini, le informazioni sulle posizioni dei punti di riferimento e l'ora in ogni posizione possono essere estratti da immagini sequenziali utilizzando l'analisi dei dati e l'elaborazione delle immagini software. Considerati insieme, questo metodo è semplice ma potente e contribuisce allo sviluppo di una maggiore efficienza negli studi basati sul traffico di membrana, come quelli che esaminano la funzione endosomi-lisosomi.

Protocol

Tutte le procedure animali sono state eseguite con l'approvazione dell'Università di Tsukuba Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Dissezione Per preparare il giorno embrionale 13-14 ICR o C57BL / 6 feti, eutanizzare i topi incinte con dislocazione cervicale. Rimuovere l'utero e metterlo in un piatto di Petri con Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Sciacquarlo bene per rimuovere il sangue. Usando le pinze, trasferire l'utero in un nuovo piatto …

Representative Results

Questo test è stato progettato per misurare la dinamica delle vescicole nella coltura in vitro . Questo saggio è stato utilizzato per determinare la motilità vescicola associata alla morfologia neuronale e alla sopravvivenza. Figura 1A e B mostrano dati rappresentativi che mostrano la motilità dei lisosomi nei neuroni. I neuroni corticali sono stati trasfettati con il marker lizosomico, LAMP-EGFP, e osservati utilizzando un microscopio stand…

Discussion

Questo protocollo introduce la procedura per quantificare la motilità della vescicola. Nei neuroni primari, endosomi e lisosomi tendono a mostrare un'elevata motilità nei neuroni più giovani (4-6 DIV). Dato che i neuroni devono fornire alcuni componenti ai bordi principali per allungare i processi neurali, il traffico di membrana dovrebbe verificarsi dinamicamente durante questa fase. Quindi, è importante utilizzare i neuroni più giovani per osservare la motilità dinamica nei dendriti neuronali. Inoltre, le ve…

Materials

Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049
Dulbecco's modified eagle medium	Wako	044-29765
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	Serum free medium
Hank's balanced salt solution	Thermo Fisher	14170112
Penicilin Streptmycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
B-27 Supplements	Thermo Fisher	17504044
2.5% Trypsine	Thermo Fisher	15090046
poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
poly-L-ornithine	Sigma	P4957
Nylon cell strainer	Corning	431750
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027	Transfection reagent
Polyethyleneimine "Max"	polysciences	24765	Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.
BIOREVO BZ-9000	Keyence	NA
Incubation system INUG2-K13	Tokay Hit	NA
GraphPad Prism version 6.0	GraphPad Software	NA
Excel version 15	Microsoft	NA
ImageJ verion 1.47	NA	NA