عزل ماليجنانت وعدم ماليجنانت ب الخلايا من lck:eGFP الزرد
Summary
الزرد المعدلة وراثيا lck:eGFP التعبير عن بروتينات فلورية خضراء عالية في الخلايا اللمفية تي، وقد استخدمت لدراسة التنمية الخلية T، وسرطان الدم الليمفاوي الحاد. يمكن استخدام هذا الخط للدراسة ب الخلايا، التي تعبر عن لك في المستويات الدنيا. ويصف هذا البروتوكول تنقية الخلايا ب الخبيثة وغير الخبيثة من الزرد lck:eGFP .
Abstract
الزرد (دانيو rerio) نموذج قوي لدراسة التنمية اللمفاويات. مثل الثدييات، تمتلك ريريو دال- المناعي التكيفي يشمل الخلايا الليمفاوية B و T. دراسات ليمفوبويسيس الزرد صعبة لأن الأجسام المضادة للاعتراف بعلامات سطح خلية ريريو دال- لا تتوافر عموما، تعقيد عزل وتوصيف للسكان اللمفاويات مختلفة، بما في ذلك النسب ب الخلايا. وكثيراً ما تستخدم خطوط المحورة وراثيا مع التعبير فلوروفوري الخاصة بالنسب للتحايل على هذا التحدي. السطر المعدلة وراثيا lck:eGFP قد استخدمت لدراسة التنمية الخلية تي ريريو دال ، وقد استخدمت أيضا لنموذج التنمية الخلية T وسرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-الكل). على الرغم من أن الأسماك lck:eGFP قد استخدمت على نطاق واسع لتحليل T-النسب، فلا قد استخدمت لدراسة الخلايا باء. في الآونة الأخيرة، اكتشفنا أن العديد من الزرد ب الخلايا أيضا التعبير عن لك، أن كان ذلك في المستويات الدنيا. ونتيجة لذلك، وبالمثل الخلايا lck:eGFP ب التعبير عن المستويات المنخفضة للتجارة والنقل. وبناء على هذا الاستنتاج، قمنا بتطوير بروتوكول لتنقية الخلايا ب-النسب من الزرد lck:eGFP ، الذي يقدم لنا هنا. لدينا طريقة توضح كيفية الاستفادة خلية تنشيط الفلورسنت فارز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتنقية الخلايا ب من أسماك lck:eGFP أو خطوط ذات الصلة، مثل rag2:hMYCمن المعدلة وراثيا مزدوجة؛ سمكة lck:eGFP . في هذه الأسطر، ب الخلايا، خلايا ب خاصة غير ناضجة، التعبير عن التجارة والنقل على مستويات منخفضة ولكن يمكن كشفها، السماح لهم بأن تميز من خلايا تي، التي تعبر عن بروتينات فلورية خضراء عالية. يمكن أن تكون الخلايا ب المعزولة من نخاع الغدة الصعترية، والطحال، والدم أو الأنسجة الأخرى. هذا البروتوكول يوفر طريقة جديدة لتنقية الخلايا ب ريريو دال ، تمكين الدراسات ركزت على مواضيع مثل التنمية الخلية ب وب اللمفاويات الأورام الخبيثة.
Introduction
وتقدم الزرد سمات قوية، مثل مانيبولابيليتي الجينية والخصوبة العالية والشفافية الضوئية والتنمية السريعة التي تسهل التنمية الفقاريات دراسة استخدام النهج الوراثية. هذه المزايا، جنبا إلى جنب مع الميزات المشتركة من هيماتوبويسيس تيليوست والثدييات، جعل ريريو دال- مثالية للتحليلات المجراة في الدالة ليمفوبويسيس واللمفاويات، من مظهرها أقرب في اليرقات طوال مرحلة البلوغ. يعتمد وضع الدم في الزرد مصانة جيدا العمليات الجينية المشتركة مع الثدييات، وهذه تشمل المناعي التكيفي. بالإضافة إلى ذلك، يحافظ الآليات الجزيئية التي تحكم التنمية اللمفاوية هي ملحوظ بين الزرد والثدييات1.
على مدى العقدين الماضيين، المعدلة وراثيا ريريو دال- خطوط الأنساب الدم محددة تسمية هذا وتم إنشاء خطوط المسخ ناقص في هذه الأنساب2،3،،من45. واحدة من هذه، السطر المعدلة وراثيا lck:eGFP ، يستخدم الزرد اللمفاويات بروتين تيروزين كيناز (لك) المروج لمحرك بروتينات فلورية خضراء التعبير6. ويسمح هذا الجين، التي يعبر عنها درجة عالية من السلائف تي-النسب والخلايا الليمفاوية T الناضجة، المجراة في تتبع التنمية الغدة الصعترية T الخلية والسابقين فيفو تنقية خلايا T-النسب بنظام مراقبة الأصول الميدانية7. سابقا، استخدمنا هذا الخط في شاشة ENU الطفرات وراثية إلى الأمام لتحديد طفرات germline المعرضة إلى T-جميع ودراسة الأحداث الوراثية المكتسبة سوماتيكالي مرتبطة بخلية T أونكوجينيسيس8،9.
في الآونة الأخيرة، تمديد مختبرنا فائدة الزرد lck:eGFP . في المعدلة وراثيا مزدوج rag2:hMYC (حركة البشرية)، ريريو دال lck:eGFP المعروفة بتطوير جميع تي 10، اكتشفنا أن النسب ب كل ما يحدث أيضا11. على عكس جميع تي في هذا النموذج الذي فلوريس الزاهية بسبب ارتفاع بروتينات فلورية خضراء التعبير، ب-جميع الخافتة فلوري بسبب انخفاض مستويات التجارة والنقل، مما يتيح الأسماك مع الجميع ب ينبغي تمييز صارخ من تلك مع تي للجميع مجهر فلوري. هذا التعبير بروتينات فلورية خضراء التفاضلية كما يسمح الفصل بين التجارة والنقل، لو ب-جميع الخلايا من بروتينات فلورية خضراءمرحبا تي-جميع الخلايا باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية11. وعلاوة على ذلك، التعبير منخفضة لك ليست فريدة من نوعها الزرد ب للجميع، الإنسان ب-جميع أيضا التعبير عن تدني مستويات لك11،12. وبالمثل، أعرب الخلايا ب-النسب الطبيعية ريريو دال، والفئران والبشر أيضا مستويات منخفضة من لك/لك/لك، مع خلايا ب غير ناضجة بعد11،التعبير أعلى13. على أساس كل خلية، أعرب الخلايا ب-النسب في خطوط الزرد أو مشتقات لكيجفب 1-10 ٪ قدر بروتينات فلورية خضراء كالخلايا اللمفية تي. هذه التجارة والنقللو خلايا مميزة صراحة مرناس بالخليه مثل pax5، cd79b، بلنك، btk، إيغم، إيغز، وغيرهم، ويمكن تنقيته من نخاع الغدة الصعترية, الطحال أو الطرفية 11من الدم. ولذلك، كلا ب-و T-النسب يمكن أن تكون الخلايا المعزولة من الزرد لكيجفب ، وفي حالة rag2hMYC، لكيجفب الحيوانات، والخلايا ب-T جميع وكذلك11.
هنا، نقدم لدينا بروتوكول لكفاءة تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية غير-ب الخلايا الخبيثة من الزرد lck:eGFP ، والخلايا ب غير خبيث أو خبيث من rag2hMYC؛ lck:eGFP الأسماك، باستخدام أنسجة مصدر مختلفة. وبالمثل يمكن قياس هذه الخلايا بالتدفق الخلوي دون عزل نظام مراقبة الأصول الميدانية، إذا رغبت في ذلك. اكتشاف انخفاض لك التعبير-ونتيجة لذلك، منخفضة تعبير بروتينات فلورية خضراء-ب الخلايا يفتح أبواباً جديدة من الاحتمالات التجريبية لكيجفب الزرد، مثل الخلية في فيفو ب الدراسات الإنمائية. وهكذا، قد هذا الخط المحورة وراثيا، ذكرت أول مرة في عام 2004، حياة جديدة ونحن نسعى إلى الاستفادة منها استخلاص أفكار جديدة بشأن الحصانة التكيفية الزرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن البلدان المتقدمة النمو ويوفر بروتوكول لعزل الخلايا ب من lck:eGFP المعدلة وراثيا الزرد، إضافة إلى نماذج أخرى ريريو دال- ب-النسب التسميات3،4هذا. بعض الشيء المثير للدهشة، ذهبت دون أن يلاحظها أحد تحديد بروتينات فلورية خضراءلو ب الخلايا في هذا ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ميغان مالون-بيريز للرعاية الزرد، ولب أووهسك التدفق الخلوي. وأيد هذا العمل منح مقدمة من شركة هيونداي الأمل على عجلات، مركز أوكلاهوما للنهوض بالعلم والتكنولوجيا (HRP-067)، جائزة مشروع تجريبي “إينبري” المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس (P20 GM103447). جكف يحمل إيل & ثلما جايلورد هبت الرئاسة في طب أمراض الدم-علم الأورام مؤسسة مستشفى للأطفال.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
References
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
