Aislar maligno y no maligno de células B lck:eGFP pez cebra
Summary
Pez cebra transgénico lck:eGFP expresan GFP altamente en los linfocitos T y se han utilizado para estudiar el desarrollo de las células T y leucemia linfoblástica aguda. Esta línea puede utilizarse para células de estudio B, que expresan lck en niveles inferiores. Este protocolo describe la purificación de las células B malignas y no malignas del pez cebra lck:eGFP .
Abstract
Pez cebra (Danio rerio) son un poderoso modelo para estudiar el desarrollo de linfocitos. Como mamíferos, D. rerio poseen un sistema inmune adaptativo que incluye linfocitos B y T. Estudios de linfopoyesis de pez cebra son difíciles porque anticuerpos reconociendo D. rerio marcadores de superficie celular generalmente no están disponibles, que complica el aislamiento y caracterización de poblaciones de diferentes linfocitos, incluyendo B-linaje células. Líneas transgénicas con expresión fluoróforo específico de linaje se utilizan a menudo para eludir este desafío. La línea transgénica lck:eGFP se ha utilizado para estudiar el desarrollo de las células T D. rerio y se ha utilizado también para el desarrollo del modelo de la célula de T y leucemia linfoblástica aguda (T-ALL). Aunque lck:eGFP peces se han utilizado ampliamente para analizar el linaje T, no ha utilizado para estudiar las células de B. Recientemente, hemos descubierto que muchas células de pez cebra B también expresan lck, aunque a niveles más bajos. Por lo tanto, las células lck:eGFP B además expresan bajos niveles de GFP. Basado en este hallazgo, hemos desarrollado un protocolo para purificar células B linaje de peces cebra lck:eGFP , que se presenta aquí. Nuestro método describe cómo utilizar un clasificador célula fluorescente activada (FACS) para purificar las células de B de pescado lck:eGFP o líneas relacionadas, tales como doble transgénico rag2:hMYC; Lck:EGFP de pescado. En estas líneas, las células B, células B particularmente inmaduras, GFP expreso en niveles bajos pero detectables, lo que les permite distinguirse de las células T que expresan GFP altamente. B células pueden ser aisladas de médula ósea, timo, bazo, sangre u otros tejidos. Este protocolo proporciona un nuevo método para purificar células B D. rerio , permitiendo estudios enfocados en temas como el desarrollo de las células B y linfocitos B malignos.
Introduction
Pez cebra ofrecen poderosos atributos, como manipulability genético, alta fecundidad, transparencia óptica y desarrollo rápido que facilitan el estudio del desarrollo de vertebrados utilizando enfoques genéticos. Estas ventajas, junto con las características compartidas de teleósteos y mamífera hematopoyesis, hacen D. rerio ideal para análisis in vivo de la linfopoyesis y linfocito función, desde su más temprana aparición en larvas a lo largo de la edad adulta. Desarrollo de sangre en el pez cebra depende de procesos genéticos bien conservados que se comparten con los mamíferos, y estos se extienden al sistema inmune adaptante. Además, los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo linfoide se conservan notable entre el pez cebra y mamíferos1.
En las últimas 2 décadas, transgénicos D. rerio líneas linajes de sangre específicos de etiqueta y las líneas mutantes deficientes en estos linajes se han creado2,3,4,5. Uno de ellos, la línea transgénica lck:eGFP , utiliza el promotor de pez cebra linfocitos proteína tirosina quinasa (lck) para unidad de expresión de GFP6. Este gen, que es altamente expresada por precursores de linaje T y los linfocitos T maduros, permite seguimiento de desarrollo de la célula de T tímico y ex vivo de purificación de las células de linaje T por FACS7en vivo. Anteriormente, utilizamos esta línea en una pantalla de mutagénesis ENU avance genético para identificar a mutantes del germline propensos a todo T y para estudiar fenómenos genéticos adquiridos somáticamente vinculados a la célula de T oncogénesis8,9.
Recientemente, nuestro laboratorio extendido más la utilidad del pez cebra lck:eGFP . En doble transgénico rag2:hMYC (MYC humano), lck:eGFP D. rerio que son conocidos por desarrollar todo T 10, descubrimos que B linaje también ocurren11. A diferencia de la T-ALL en este modelo, que es fluorescente brillante debido a la alta expresión de GFP, B-todos son débilmente fluorescente debido a niveles bajos de la GFP, que pescado con B-todo distinguirse groseramente de los T-todo por microscopia fluorescente. Esta expresión de GFP diferencial también permite la separación de GFPlo -todas las células desde GFPHola células T-todos usando FACS11. Por otra parte, expresión de lck de baja no es exclusiva de pez cebra B-ALL, como humanos-todas también expresan bajos niveles de LCK11,12. Asimismo, células normales B-linaje de D. rerio, ratones y seres humanos también expresan niveles bajos de lck/Lck/LCK, células B inmaduras con la más alta expresión11,13. Sobre una base por celular, las células de linaje B en líneas de pez cebra o derivado de lckeGFP expresan 1-10% tanto GFP como los linfocitos T. Estos GFPlo expresa característica mRNAs de la célula de B como pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzy otros de las células y puede ser purificado de la médula ósea, timo, bazo o periférico la sangre11. Por lo tanto, ambos linaje B y T las células pueden ser aisladas de pez cebra lckeGFP y en caso de rag2hMYC, lckeGFP animales, células B y T todos así11.
Aquí, presentamos nuestro protocolo eficiente FACS purificar células no malignas B de pez cebra lck:eGFP y las células de B no malignos o malignas de rag2hMYC; Lck:EGFP peces, con varios tejidos de origen. Tales células pueden cuantificarse por el flujo cytometry sin aislamiento de FACS, además si lo desea. Descubrimiento de la expresión de lck de baja- y en consecuencia, la baja expresión de GFP-b células abre nuevas puertas de posibilidades experimentales del pez cebra lckeGFP , como vivo en B estudios del desarrollo de la célula. Así, esta línea transgénica, primero divulgada en 2004, tiene nueva vida al intentar utilizarlo para obtener ideas frescas sobre inmunidad adaptativa de pez cebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desarrollamos y proporcionar un protocolo para aislar las células de B de pez cebra transgénico lck:eGFP , añadir esto a otros modelos de D. rerio con linaje B etiquetas3,4. Sorprendentemente, la identificación de GFPlo B células en esta línea pasó desapercibida desde su descripción en el año 2004. Generalmente, lck es considerada específica de la célula de T6, pero estudios recientes encont…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Megan Malone-Perez para el cuidado del pez cebra y la base de cytometry del flujo OUHSC. Este trabajo fue financiado por becas del Hyundai Hope sobre ruedas, el centro de Oklahoma para el avance de la ciencia y la tecnología (HRP-067), un premio de proyecto piloto de INBRE NIH/NIGMS (P20 GM103447). JKF sostiene el E.L. & Thelma Gaylord Cátedra en hemato-oncología pediátrica de la Fundación del Hospital de los niños.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
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