Isolando il maligno e le cellule di B Non-maligna da lck:eGFP Zebrafish
Summary
Zebrafish transgenici lck:eGFP esprimono GFP altamente nei linfociti T e sono stati usati per studiare lo sviluppo delle cellule T e la leucemia linfoblastica acuta. Questa linea può essere utilizzato per Studio B cellule, che esprimono lck a livelli inferiori. Questo protocollo descrive la purificazione delle cellule di B maligne e benigne da lck:eGFP zebrafish.
Abstract
Zebrafish (Danio rerio) sono un potente modello per studiare lo sviluppo del linfocita. Come mammiferi, d. rerio possiedono un sistema immunitario adattativo che include i linfociti B e T. Gli studi di zebrafish linfopoiesi sono difficili perché anticorpi che riconoscono i marcatori di superficie delle cellule di d. rerio non sono generalmente disponibili, isolamento e caratterizzazione di popolazioni linfocitarie diverse, tra cui B-stirpe di complicazione cellule. Linee transgeniche con espressione fluoroforo lineage-specifici sono spesso utilizzati per aggirare questa sfida. La linea transgenica lck:eGFP è stata utilizzata per studiare lo sviluppo delle cellule di T di d. rerio e inoltre è stata utilizzata per lo sviluppo delle cellule di T di modello e leucemia linfoblastica acuta (LAL-T). Anche se lck:eGFP pesce sono stati ampiamente usati per analizzare il T-stirpe, essi non sono stati utilizzati per studiare le cellule B. Recentemente, abbiamo scoperto che molte cellule di zebrafish B esprimono anche lck, seppur a livelli inferiori. Di conseguenza, le cellule lck:eGFP B similarmente esprimono bassi livelli di GFP. Sulla base di questa individuazione, abbiamo sviluppato un protocollo per purificare le cellule di B-stirpe da lck:eGFP zebrafish, che segnaliamo qui. Il nostro metodo viene descritto come utilizzare un sorter fluorescente-attivata delle cellule (FACS) per purificare le cellule B da lck:eGFP pesce o righe correlate, ad esempio transgenici doppio rag2:hMYC; pesce LCK:EGFP . In queste righe, cellule B, cellule B particolarmente immature, GFP espressa a livelli bassi ma rilevabili, consentendo loro di essere distinto dalle cellule T, che esprimono GFP altamente. B cellule possono essere isolate da midollo osseo, timo, milza, sangue o altri tessuti. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per purificare le cellule di B di d. rerio , abilitazione studi incentrati su temi come lo sviluppo delle cellule B e le malignità del linfocita B.
Introduction
Zebrafish offrono potenti attributi, ad esempio manipolabilità genetica, alta fecondità, ottico traslucenza e rapido sviluppo che semplificano lo sviluppo vertebrato Studio utilizzando approcci genetici. Questi vantaggi, insieme con le funzionalità condivise di teleostei e mammiferi ematopoiesi, rendono d. rerio ideale per analisi in vivo della funzione del linfocita e linfopoiesi, dalla loro prima apparizione nelle larve durante l’età adulta. Sviluppo di sangue in zebrafish si basa su processi genetici ben conservati che vengono condivisi con i mammiferi, e questi si estendono per il sistema immunitario adattativo. Inoltre, i meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo linfoide notevolmente sono conservate tra zebrafish e mammiferi1.
Negli ultimi 2 decenni, linee transgeniche d. rerio lignaggi di sangue specifico tale etichetta e linee mutanti carenti in queste linee cellulari sono state create2,3,4,5. Uno di questi, la linea transgenica lck:eGFP , utilizza il promotore di zebrafish del linfocita proteina tirosina chinasi (lck) a guidare la GFP espressione6. Questo gene, che è altamente espressa da precursori di LAL-T e i linfociti T maturi, permette in vivo monitoraggio dello sviluppo della cellula T timica ed ex vivo purificazione delle cellule di T-stirpe di FACS7. In precedenza, abbiamo usato questa linea in uno schermo di mutagenesi ENU avanti-genetica per identificare i mutanti di germline inclini a LAL-T e per studiare eventi genetici somatico acquisito legati a cellula T oncogenesi8,9.
Recentemente, il nostro laboratorio esteso ulteriormente l’utilità di lck:eGFP zebrafish. In transgenici doppio rag2:hMYC (MYC umano), lck:eGFP D. rerio che sono noti per sviluppare LAL-T 10, abbiamo scoperto che LAL-B si verificano anche11. A differenza di LAL-T in questo modello, che reagiscono in brillantemente dovuto l’alta espressione di GFP, B-tutti sono scarsamente-fluorescenti a causa di bassi livelli di GFP, permettendo il pesce con B-ALL per essere distinti grossolanamente da quelli con LAL-T da microscopia fluorescente. Questa espressione di GFP differenziale consente inoltre la separazione di cellule GFPlo B-tutti da GFPCiao cellule T-ALL usando FACS11. Inoltre, espressione di basso lck non è univoco per zebrafish B-ALL, come umano anche esprimere bassi livelli di B-ALL di LCK11,12. Allo stesso modo, le cellule normali di B-stirpe di d. rerio, topi e gli esseri umani esprimono anche bassi livelli di lck/LckLCK, con cellule di B acerbe che hanno la più alta espressione11,13. Su una base per cellula, le cellule di B-stirpe in linee di zebrafish o derivato di lckeGFP express 1-10% tanto GFP come linfociti T. Questi GFPlo cellule espressa caratteristica delle cellule di B mRNA come pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighze altri e possa essere purificate dal midollo osseo, timo, milza o periferico 11del sangue. Di conseguenza, entrambi LAL-B e T-cellule possono essere isolato da lckeGFP zebrafish e nel caso di rag2hMYC, lckeGFP animali, anche le cellule di B – e T-ALL11.
Qui, vi presentiamo il nostro protocollo efficiente FACS-purificare B cellule benigne da lck:eGFP zebrafish e benigne o maligne cellule di B di rag2hMYC; LCK:EGFP pesce, utilizzando vari tessuti di origine. Tali cellule allo stesso modo possono essere quantificate mediante citometria a flusso senza isolamento FACS, se lo si desidera. Scoperta di espressione bassa lck – e di conseguenza bassa espressione di GFP-di B cellule apre nuove porte di possibilità sperimentali per lckeGFP zebrafish, come in vivo B cella studi evolutivi. Così, questa linea transgenica, primo luogo segnalata in 2004, ha una nuova vita come cerchiamo di utilizzarlo per raccogliere nuove intuizioni relative all’immunità adattativa zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato e fornire un protocollo per isolare le cellule B da lck:eGFP zebrafish transgenici, l’aggiunta di questo ad altri modelli di d. rerio con B-stirpe etichette3,4. Abbastanza sorprendentemente, l’identificazione delle GFPlo B cellule in questa linea passò inosservato dalla relativa descrizione nel 2004. In genere, lck è considerato specifico delle cellule T6, ma recenti studi trovano …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Megan Malone-Perez per cura di zebrafish e il nucleo di cytometry di flusso OUHSC. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Hyundai Hope su ruote, il centro dell’Oklahoma per l’avanzamento della scienza e tecnologia (HRP-067), un premio del progetto pilota di NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF detiene il E.L. & Thelma Gaylord dotata di sedia in ematologia-oncologia pediatrica della Fondazione Ospedale dei bambini.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
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