从 lck 中分离恶性和非恶性 b 细胞: egfp斑马鱼
Summary
转基因lck: egfp斑马鱼在 t 淋巴细胞中表达 gfp 的高度, 并已被用于研究 t 细胞发育和急性淋巴细胞白血病。这条线可以用来研究 b 细胞, b 细胞在较低的水平上表达lck 。该协议描述了从lck: egfp斑马鱼的恶性和非恶性 b 细胞的纯化。
Abstract
斑马鱼 (daio rerio)是研究淋巴细胞发育的一个强有力的模型。像哺乳动物一样, d. rerio拥有包括 b 和 t 淋巴细胞在内的适应性免疫系统。斑马鱼淋巴生成的研究是困难的, 因为抗体识别d. rerio 细胞表面标记物一般是不可用的, 使分离和表征不同的淋巴细胞群, 包括 b 系细胞。具有血统特异性荧光体表达的转基因线经常被用来规避这一挑战。转基因lck:egfp系已被用于研究d. rerio t 细胞的发育, 也被用于模型 t 细胞发育和急性淋巴细胞白血病 (t-all)。虽然lck:egfp鱼被广泛用于分析 t 系, 但它们还没有被用来研究 b 细胞。最近, 我们发现, 许多斑马鱼 b 细胞也表达了 lck, 尽管水平较低。因此, lck:egfp b 细胞同样表达低 gfp 水平。基于这一发现, 我们开发了一个从lck: egfp斑马鱼净化 b 系细胞的协议, 我们在这里报告。我们的方法描述了如何利用荧光激活细胞分选器 (facs) 从lck: egfp鱼或相关的线, 如双转基因的 ragycb 细胞纯化;egfp 鱼。在这些细胞中, b 细胞, 特别是不成熟的 b 细胞, 在较低但可检测的水平上表达 gfp, 使它们能够与 t 细胞区分开来, 从而高度表达 gfp。b 细胞可以从骨髓、胸腺、脾脏、血液或其他组织中分离出来。该方案提供了一种净化d. rerio b 细胞的新方法, 使研究的重点是 b 细胞发育和 b 淋巴细胞恶性肿瘤等主题。
Introduction
斑马鱼具有强大的特性, 如遗传操纵能力、高繁殖力、光学半透明和快速发育, 有助于利用遗传方法研究脊椎动物的发育。这些优势, 再加上远端和哺乳动物造血的共同特征, 使d. rerio 成为在体内分析淋巴细胞和淋巴细胞功能的理想选择, 从它们在整个成年期间在幼虫中的最早出现。斑马鱼的血液发育依赖于与哺乳动物共享的保存良好的遗传过程, 这些过程延伸到适应性免疫系统。此外, 斑马鱼和哺乳动物之间的分子机制在淋巴发育方面得到了显著的保护。
在过去的20年里, 在这些血统中缺乏的特定血液谱系和突变系的转基因d. rerio 系已经被创造出来 2,3,4,5。其中, lck: egfp转基因线, 利用斑马鱼淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶 (lck) 启动子来驱动 gfp 表达 6.该基因由 t 系前体和成熟的 t 淋巴细胞高度表达, 可通过流式细胞仪7在体内跟踪胸腺 t 细胞的发育和 t 系细胞的体外纯化.以前, 我们在前瞻性遗传 enu 突变屏幕中使用这条线来识别容易发生 t-all 的种系突变体, 并研究与 t 细胞肿瘤发生 8,9有关的体细胞获得的基因事件。
最近, 我们的实验室进一步扩大了lck 的效用: egfp斑马鱼。在双转基因的 rmyc (人 myc), lck:egfp d. rerio,已知开发 t-all 10,我们发现 b-血统 all 也发生11。与 t-all 在这个模型中不同的是, 由于 gfp 表达较高, t-all 荧光明亮, 由于 gfp 水平较低, 允许 b-all 的鱼与使用荧光显微镜的鱼区别开来。这种差异 gfp 表达还允许使用流式细胞管制11将 gfp lo b-all 细胞与 gfphit-all 细胞分离.此外, 低lck表达并不是斑马鱼 b-all 所独有的, 因为人类 b-all 也表达低lck11,12。同样, d. rerio、小鼠和人类的正常 b 系细胞表达的 lck/lck/lck 水平也很低, 不成熟的 b 细胞的表达最高11,13. 在每个细胞的基础上, b-沿袭细胞在lckegfp zzbrafish 或衍生物线表示1-10 尽可能多的 gfp t 淋巴细胞。这些 gfplo细胞表达典型的 b 细胞 mrna, 如pax5、 cd79b、 blnk、btk、 ighm、 ighm等, 可以从骨髓、胸腺、脾脏或外周中纯化血11。因此, b-和 t 系细胞都可以从lckegfp zebrafish 中分离, 在rag2hMYC、 lckegfp动物、b-和 t-all 细胞的情况下, 也可以分离出11。
在这里, 我们提出了我们的方案, 以有效地 facs 纯化非恶性 b 细胞从 lck: egfp斑马鱼, 和非恶性或恶性 b 细胞的 rag2hMYC; egfp鱼, 使用各种来源组织。如果需要, 这种细胞同样可以通过流式细胞术量化, 而无需流式细胞仪分离。低lck表达的发现–因此, 低 gfp 表达 b 细胞为lckegfp zzbrafish 的实验可能性打开了新的大门, 例如体内b 细胞的发育研究。因此, 这条在2004年首次报道的转基因线, 有了新的生命, 因为我们试图利用它来收集关于斑马鱼适应性免疫的新见解。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们开发并提供了一种从 lck 中分离 b 细胞的协议: egfp转基因斑马鱼, 并将其添加到其他带有 b 系标签 3,4的 d . rerio 模型中。有些令人惊讶的是, 自2004年描述以来, 这一行中 gfplo b 细胞的识别没有引起注意。一般来说, lck被认为是 t 细胞特有的6, 但最近的研究发现, 自然杀手和骨髓细胞, 以及 b 细胞中的意外 lc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢梅加马龙-佩雷斯对斑马鱼的护理, 以及 ouhsc 流式细胞仪的核心。这项工作得到了现代希望车轮、俄克拉荷马科学和技术促进中心 (hrp-067)、nihx\ igms inbre 试点项目奖 (p20 gm103447) 的资助。jkf 担任急诊室 & 西尔玛·盖洛德, 担任儿童医院基金会儿科血学-肿瘤学主席。
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
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