Isolando a maligna e as células B não-maligna do lck:eGFP Zebrafish
Summary
Zebrafish transgênicos lck:eGFP express GFP altamente em linfócitos T e têm sido usados para estudar o desenvolvimento de células T e a leucemia linfoblástica aguda. Esta linha pode ser usado para células de estudo B, que expressam lck em níveis inferiores. Este protocolo descreve a purificação das malignas e não-malignas de células B de lck:eGFP zebrafish.
Abstract
Peixe-zebra (Danio rerio) é um poderoso modelo para estudar o desenvolvimento de linfócitos. Como mamíferos, d. rerio possuem um sistema imune adaptativo que inclui linfócitos B e T. Estudos de zebrafish linfopoiese são difíceis porque os anticorpos reconhecendo d. rerio marcadores de superfície celular geralmente não estão disponíveis, complicando o isolamento e caracterização de populações de linfócitos diferentes, incluindo B-linhagem células. Linhas transgénicas com linhagem específicas fluoróforo expressão são frequentemente utilizadas para contornar esse desafio. A linha de transgênicos lck:eGFP tem sido usada para estudar o desenvolvimento de células T d. rerio e também tem sido utilizada para o modelo de desenvolvimento de células T e a leucemia linfoblástica aguda (T-ALL). Embora lck:eGFP peixe têm sido amplamente utilizados para analisar a linhagem T-, eles não foram usados para estudar as células B. Recentemente, descobrimos que muitos zebrafish B células também expressam lck, embora em níveis inferiores. Consequentemente, lck:eGFP B células da mesma forma expressam níveis baixos de GFP. Baseado nesta constatação, desenvolvemos um protocolo para purificar as células B-linhagem de lck:eGFP zebrafish, que relatamos aqui. Nosso método descreve como utilizar um classificador fluorescente-ativado da pilha (FACS) para purificar as células B de peixe lck:eGFP ou linhas relacionadas, tais como double-transgénicos, rag2:hMYC; lck:eGFP peixe. Nestas linhas, células B, as células B particularmente imaturas, GFP expresso em níveis baixos, mas detectáveis, permitindo que eles sejam distintos de células T, que expressam a GFP altamente. As células B podem ser isoladas da medula, timo, baço, sangue ou outros tecidos. Este protocolo fornece um novo método para purificar as células B d. rerio , permitindo estudos focados em temas como o desenvolvimento de células B e linfócitos B malignidades.
Introduction
Zebrafish oferecer atributos poderosos, como manipulability genética, alta fecundidade, translucidez óptico e desenvolvimento rápido que facilitam o desenvolvimento de vertebrados estudando usando abordagens genéticas. Estas vantagens, juntamente com os recursos compartilhados de teleósteos e mamíferos hematopoiese, fazem d. rerio ideal para análises in vivo da função linfopoiese e linfócitos, de sua aparência mais antiga em larvas em toda a idade adulta. Desenvolvimento de sangue no zebrafish assenta bem conservados processos genéticos que são compartilhados com mamíferos, e estes se prolongam para o sistema imune adaptativo. Além disso, os mecanismos moleculares que regem o desenvolvimento linfoide são notavelmente conservados entre zebrafish e mamíferos1.
Nas últimas 2 décadas, transgénicos d. rerio linhas que linhagens de sangue específico de rótulo e linhas mutantes deficientes nestas linhagens foram criadas2,3,4,5. Um destes, a lck:eGFP linha de transgénicos, usa o promotor zebrafish linfócito proteína tirosina quinase (lck) para direcionar a GFP expressão6. Este gene, que é altamente expressa por ambos precursores de T-linhagem e linfócitos T maduros, permite em vivo, monitoramento do desenvolvimento do timo de células T e ex vivo da purificação de células T-linhagem por FACS7. Anteriormente, usamos esta linha em uma tela de mutagénese ENU para diante-genética para identificar germline mutantes propensos a T-ALL e estudar adquiridas somaticamente genéticos eventos ligados à célula T mixomas8,9.
Recentemente, nosso laboratório alargado a utilidade do lck:eGFP zebrafish. Em duplo-transgênicos rag2:hMYC (MYC humana), lck:eGFP D. rerio que são conhecidos por desenvolver T-tudo 10, descobrimos que B-linhagem todos também ocorrem11. Ao contrário de T-tudo neste modelo, que fluorescem brilhantemente devido a alta expressão de GFP, B-ALL são palidamente fluorescentes devido aos baixos níveis GFP, permitindo peixe com B-tudo a ser distinguida grosseiramente aqueles com T-ALL por microscopia fluorescente. Esta expressão diferencial de GFP também permite a separação de GFPEis B-todas as células de GFPOi células T-ALL usando FACS11. Além disso, baixa lck expressão não é exclusivo do zebrafish B-ALL, como humanos B-ALL também expressam os baixos níveis de LCK11,12. Da mesma forma, as células normais de B-linhagem de d. rerio, camundongos e humanos também expressam níveis baixos de lck/Lck/LCK, com as células B imaturas, tendo a mais alta expressão11,13. Em uma base por célula, as células B-linhagem em linhas de zebrafish ou derivado de lckeGFP expressam 1-10% tanto GFP como linfócitos T. Estes GFPEis células expressa característica mRNAs de células B como pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighze outros e podem ser purificado a partir da medula, timo, baço ou periférico sangue,11. Portanto, ambos linhagem B – e T-células podem ser isolado de lckeGFP zebrafish e no caso de rag2hMYC, lckeGFP animais, células B e T-tudo bem como11.
Aqui, apresentamos nosso protocolo para eficientemente FACS-purificar não-malignas células B de lck:eGFP zebrafish e não-malignas ou malignas de células B de rag2hMYC; lck:eGFP peixe, usando vários tecidos de origem. Tais células da mesma forma podem ser quantificadas por citometria de fluxo, sem isolamento de FACS, se desejado. Descoberta de baixo lck expressão- e consequentemente, baixa expressão de GFP-por B células abre novas portas de possibilidades experimentais para lckeGFP zebrafish, tais como estudos do desenvolvimento de células vivo em B. Assim, esta linha de transgénica, relatada pela primeira vez em 2004, tem vida nova como buscamos para utilizá-lo para recolher ideias frescas relativa imunidade adaptativa zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolvemos e fornecer um protocolo para isolar as células B de lck:eGFP zebrafish transgênicos, adicionando isso para outros modelos de d. rerio com B-linhagem rótulos3,4. Surpreendentemente, a identificação de GFPEis B células nesta linha passou despercebida desde sua descrição em 2004. Geralmente, lck é considerado de células T específicas6, mas os estudos recentes encontraram expressã…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Megan Malone-Perez para cuidados de zebrafish e o núcleo de citometria de fluxo OUHSC. Este trabalho foi financiado por doações de Hyundai Hope sobre rodas, o centro de Oklahoma para o avanço da ciência e tecnologia (HRP-067), um prêmio de projeto piloto de NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF detém o E.L. & Thelma Gaylord dotado cadeira em Hematologia-Oncologia Pediátrica da Fundação do Hospital de crianças.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
References
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
