Meten van fagocytose van Aspergillus fumigatus conidia door menselijke leukocyten met behulp van Flowcytometrie
Summary
Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare methode voor het kwantificeren van de fagocytose van Aspergillus fumigatus conidiën door humane primaire fagocyten met behulp van Flowcytometrie en om de fagocytose van conidiën te onderscheiden van de loutere hechting op leukocyten.
Abstract
Invasieve pulmonale infectie door de schimmel Aspergillus fumigatus vormt een grote bedreiging voor immuungecompromitteerde patiënten. Geïnhaleerde schimmel conidiën (sporen) worden uit de menselijke Long longblaasjes geklaard door fagocytosed te zijn door aangeboren monocyten en/of neutrofielen. Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare meting van de fagocytose door Flowcytometrie met behulp van fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-gelabelde conidiën voor coincubatie met menselijke leukocyten en daaropvolgende tegen kleuring met een antilichaam tegen FITC om discriminatie van geïnternationaliseerde en cel-aanhangende conidiën mogelijk te maken. Belangrijke voordelen van dit protocol zijn de snelheid, de mogelijkheid om de test te combineren met cytometrische analyse van andere celmarkeringen van belang, de gelijktijdige analyse van monocyten en neutrofielen uit een enkel monster en de toepasbaarheid ervan op andere celwanddragende schimmels of bacteriën. Bepaling van de percentages van phagocytosing leukocyten biedt een middel aan microbiologen voor de beoordeling van de virulentie van een pathogeen of voor het vergelijken van ziekteverwekkers en mutanten, alsook aan immunologen voor het onderzoeken van menselijke leukocyten capaciteiten om pathogenen te bestrijden.
Introduction
Invasieve pulmonale aspergillose is een grote bedreiging voor immuungecompromitteerde patiënten omdat behandelingsopties beperkt zijn en alleen succesvol zijn bij vroege diagnose, wat leidt tot hoge sterftecijfers1. Infectieuze agentia zijn conidiën (sporen) van de schimmel Aspergillus fumigatus die alomtegenwoordig zijn voor de meeste habitats2. Conidia worden geïnhaleerd, passeren de luchtwegen en kunnen eindelijk de Long alveoli binnengaan. Bij immunocompetente mensen worden deze conidiën geklaard door aangeboren immuuncellen zoals monocyten of macrofagen en Neutrofiele granulocyt, die nemen (fagocytose) en de pathogenen verteren3. Fagocytose is ook belangrijk voor microbiologen en immunologen wanneer ze geïnteresseerd zijn in interacties tussen gastheer en pathogeen. Confrontatie testen, zoals coincubatie van leukocyten en conidia, omvatten vaak het labelen van de sporen door fluoresceïne of zijn afgeleide fluoresceïne isothiocyanaat (FITC). Met behulp van een microscoop is het eenvoudig om geïnternationaliseerde fluorescentie-conidiën te identificeren en om de bijgevoegde/aanhandige conidiën te bepalen, hoewel deze aanpak omslachtig is en realistisch beperkt tot enkele honderden cellen4. Echter, in flow cytometrie waardoor de analyse van honderdduizenden cellen binnen enkele minuten gemakkelijk is, is differentiële kleuring van phagocytosed en aanhandige conidiën van vitaal belang. Daarom zijn veel protocollen gebaseerd op trypan Blue om FITC-fluorescentie te blusen van de aanhandige conidiën5,6,7,8. Een andere aanpak is het benutten van fluorescentie resonantie energie overdracht van ethidiumbromide bromide en FITC om rood uit te stoten in plaats van groene fluorescentie van aanhanger conidiën9,10,11. Als er specifieke antilichamen beschikbaar zijn, zoals bij sommige bacteriën, kunnen cel-gebonden deeltjes direct worden gekleurd12,13.
Hier presenteren we een protocol voor het snel en kwantitatief beoordelen van fagocytose van FITC-gelabelde a. fumigatus conidiën door menselijke leukocyten samen met een bevestiging van sporen aan cellen en een gebrek aan interactie door gebruik te maken van een allophycocyanin (APC)-gekoppeld anti-FITC-antilichaam. De methode maakt het ook mogelijk voor de gelijktijdige Flow cytometrische analyse van verdere celmarkeringen die kunnen worden gebruikt voor een afzonderlijke analyse van fagocytose door monocyten en neutrofielen uit hetzelfde monster.
Het protocol kan worden toegepast voor de karakterisering van schimmel stammen (bijv. verschillende soorten Aspergillus en andere mallen van het geslacht Mucorales hier gepresenteerd) en hun mutanten14 en immunologische onderzoek op fagocyten, zoals leukocyten van immuungecompromitteerde individuen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol presenteert een Fast Flow cytometrische methode voor het meten van de interactie van a. fumigatus conidiën met een groot aantal primaire menselijke leukocyten die niet mogelijk is in gemeenschappelijke microscopische protocollen. Beeldvormings cellen met een microscoop en handmatig de geïnternationaliseerde conidiën tellen zijn omslachtig en kunnen realistisch worden gedaan voor een paar honderd cellen. Flow flowcytometrieonderzoeken overkomt dit probleem door het meten van duizenden cellen binne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken mevrouw Pia stier voor de uitstekende technische bijstand. M. von Lilienfeld-Toal wordt ondersteund door het centrum voor sepsis controle en verzorging (Duits Federaal Ministerie van onderwijs en gezondheid, BMBF, FKZ 01E01002) en InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang wordt gesteund door de school voor microbiële communicatie van Jena (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
