Summary

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

Published: December 07, 2019
doi:

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואמינה כדי לכמת את phagocyציטוזה של אספגינוס באמצעות הפגוציטים הגוף האנושי באמצעות הזרימה cy, try ולהפלות את הפגוציטוזה של המחט מתוך הדבקה ללוקוציטים בלבד.

Abstract

דלקת בריאות פולשנית על ידי העובש אספרגייוס , מהווה איום גדול לחולים בסיכון חיסוני. שאפה פטרייתי פטריות (נבגים) נמחקים מן הריאה האנושית מכתשי על ידי להיות phagocytosed על ידי מונוציטים מולדת ו/או נויטרופילים. פרוטוקול זה מציע מדידה מהירה ואמינה של phagocyציטוזה על ידי זרימה cy, באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-מחט המסומנת לשיתוף הדגירה עם לוקיציטים האדם ולאחר הצביעת נגד נוגדנים נגד FITC כדי לאפשר אפליה של הפנפינט ותאי-חסיד המחט. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם מהירות, האפשרות לשלב את הטיפול עם ניתוח ציטומטרי של סמני תאים אחרים של עניין, הניתוח הסימולטני של מונוציטים ונויטרופילים ממדגם אחד את הישימות שלה כדי הקיר אחר הנושאת הפטריות או חיידקים. קביעת אחוזים של לוקיציטים מספקת אמצעי למיקרו-ביולוגים להערכת התקפה אלימה של פתוגן או להשוואת סוגי הפתוגן והמוטציות, כמו גם למחלות אימונולוגים לחקירת יכולות לוקמיה אנושיים כדי להילחם בפתוגנים.

Introduction

הריאות פולשנית הריאתי הוא איום גדול לחולים חיסוני כמו אפשרויות הטיפול מוגבלות ורק מוצלח על אבחנה מוקדמת, אשר מוביל שיעורי תמותה גבוה1. החומרים הזיהומיות הם עצי מחט (נבגים) של העובש אספרגייוס , שנמצאים בכל מקום לבתי הגידולהשניים. המחט משאפים, עוברים דרך דרכי הנשימה והוא יכול לבסוף להיכנס לריאות מכתשי. בבני אדם החיסונית, המחט האלה מנוקה על ידי תאים חיסוניים מולדים כגון מונוציטים או מקרופאגים ו נויטרופילים גרנולוציטים, אשר לקחת (phagocytose) ולעכל את פתוגנים3. Phagocyציטוזה חשוב עבור מיקרו ביולוגים ואימונוולוגים גם כאשר מעוניינים אינטראקציה המארחים-הפתוגן. העימות אומר, כגון דגירה שיתוף של לוקיציטים ו מחט, לעתים קרובות כוללים תיוג של הנבגים על ידי fluorescein או הנגזרת הנגזרות שלה isothiocyanate (FITC). באמצעות מיקרוסקופ, זה פשוט לזהות את המחט פלורסנט הפנפנידיה כדי לקבוע המחט מצורף/חסיד, למרות גישה זו היא מסורבלת מוגבלת מציאותית לכמה מאות תאים4. עם זאת, בזרימה cy, אשר בקלות מאפשר ניתוח של מאות אלפי תאים בתוך דקות, מכתים ההפרש של המחט המגולמת וחסיד הוא חיוני. לכן, פרוטוקולים רבים מסתמכים על טריפה כחול כדי להרוות את הקרינה הפלואורסצנטיתמתוך מחט של 5,6,7,8. גישה נוספת היא לנצל את העברת אנרגיה התהודה הפלואורסצנטית של אתידיום ברומיד ו fitc לפלוט אדום במקום זריחה ירוקה מ חסיד מחט9,10,11. אם יש נוגדנים מסוימים זמינים, כמו במקרה של חיידקים מסוימים, חלקיקים מאוגדים תא יכול להיות מוכתם באופן ישיר12,13.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול במהירות ובקוונטי להעריך phagocyציטוזה של התווית FITC מתויג על ידי האדם לוקיציטים, יחד עם החזקה של נבגים לתאים וחוסר אינטראקציה על ידי העסקת allophycocyanin (APC)-ביחד נוגדן ANTI-fitc. השיטה מאפשרת גם ניתוח הציטוטומטט זרימה בו של סמנים תאים נוספים, כי ניתן ליישם ניתוח נפרד של phagocyציטוזה על ידי מונוציטים ו נויטרופילים מאותה דוגמית.

הפרוטוקול יכול להיות מיושם על אפיון של זנים פטרייתיים (למשל, מינים של אספרגינוס וצורות אחרות מסוג mucorales הציג כאן) ואת המוטציות שלהם14 ו מחקר אימונולוגיים על phagocytes, כגון לוקיציטים מאנשים שנפגעו חיסוני.

Protocol

פרוטוקול זה כולל את השימוש של מעילים באפי האדם שהתקבלו מן המכון לרפואה עירוי, אוניברסיטת יינה בית החולים ובדם ורידי טרי שנמשך מחולים, הן לאחר בכתב הסכמה מושכלת של התורמים על פי אישור ועדת האתיקה 4357-03/15. 1. הכנת אספיוס מחטאים . תגדל בירה. ב1.5% מאלט מנות פטרי במשך 5 ?…

Representative Results

ב מדידת phagocyציטוזה של א. חיטוי המחט על ידי התאים האנושיים phagocytosis, האפליה בין הפנמה אמיתי מצורף גרידא של מחט לתאים הוא מכשול, במיוחד כשמדובר בשיטות תפוקה גבוהה כגון הזרימה cy, לנסות. על מנת להתגבר על משוכה זו, אנו מציגים פרוטוקול מהיר ואמין מבוסס על כתמים של עצי מחט עם צבען פלורסנט FITC לפני …

Discussion

פרוטוקול זה מציג שיטת הזרמה מהירה של הסייטוטומטל למדוד אינטראקציה של המחט. בעלת מספר רב של לוקיציטים אנושיים מרכזיות שאינן אפשריות בפרוטוקולים מיקרוסקופים משותפים. הדמיה תאים עם מיקרוסקופ באופן ידני לספור הפניהמחט היא מסורבלת יכול להיעשות בצורה מציאותית עבור כמה מאות תאים בלבד. הא?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לגברת פיה שטיר על סיוע טכני מעולה. מ. פון לילינפלד-Toal הוא נתמך על ידי המרכז לבקרת אלח דם וטיפול (משרד הפדרלי הגרמני של החינוך והבריאות, BMBF, FKZ 01E01002) והנגועים בקמפוס המחקר הגנוסטים (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai ואנג נתמך על ידי בית הספר היינה של תקשורת מיקרוביאלית (דויטשה פורשונגסביסםגיסמייססבאחאי, FKZ 214/2)

Materials

Adhesive foil Brand 701367
anti-CD14 V500 BD Biosciences 561391 clone M5E2
anti-CD45 BUV395 BD Biosciences 563792 clone HI30
anti-CD66b PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 562254 clone G10F5
anti-FITC APC ThermoFisher Scientific 17-7691-82 clone NAWESLEE
Cell culture plate, 12-well Greiner Bio-one 665180
Cell scraper Bioswisstech 800020
Cell strainer, 30 µm Miltenyi Biotech 130-098-458 SmartStrainer
Cytometer BD Biosciences LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)
Detergent Sigma Aldrich P1379 Tween 20, 0.01% in PBS
Drigalski spatula Carl Roth PC59.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED3SS-500g 2 mM in PBS
Erythrocyte lysis buffer 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA
Fetal Calf Serum (FCS) Biochrom AG S 0115 10% in RPMI 1640
Fluorescein isothiocyanate (FITC) Sigma Aldrich F3651-100MG 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution
Formaldehyd Carl Roth PO87.3 Histofix
Malt agar (1.5%) malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes
Na2CO3 Carl Roth 8563.1 0.1 M in PBS
Petri dish Greiner Bio-one 633180
Phosphat Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 189012-014 without Calcium, without Magnesium
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 61870010 RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement
Rotator Miltenyi Biotech 130-090-753 MACSmix Tube Rotator
Round-bottom tube, 7.5 mL Corning REF 352008
Software for data acquisition and analysis BD Biosciences FACSDiva 8.0
V-bottom plate, 96 well Brand 781601 untreated surface

References

  1. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
  2. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  3. Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
  4. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  5. Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
  6. Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
  7. Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
  8. Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
  9. Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
  10. Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
  11. Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
  12. Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
  13. de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
  14. Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
  15. Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).

Play Video

Cite This Article
Hartung, S., Rauh, C., Böttcher, S., Hoang, M. T. N., Jahreis, S., Rummler, S., Hochhaus, A., von Lilienfeld-Toal, M. Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (154), e60397, doi:10.3791/60397 (2019).

View Video