Mesure de la phagocytose d'Aspergillus fumigatus Conidia par des leucocytes humains à l'aide de la cytométrie du flux
Summary
Ce protocole fournit une méthode rapide et fiable pour mesurer quantitativement la phagocytose d’Aspergillus fumigatus conidia par les phagocytes primaires humains utilisant la cytométrie de flux et pour discriminer la phagocytose des conidies de la simple adhérence aux leucocytes.
Abstract
L’infection pulmonaire invasive par le moule Aspergillus fumigatus pose une grande menace pour les patients immunocompromis. Les concarnes fongiques inhalées (spores) sont éliminées des alvéoles pulmonaires humaines en étant phagocytosed par des monocytes innés et/ou des neutrophiles. Ce protocole offre une mesure rapide et fiable de la phagocytose par cytométrie de flux utilisant des conidies étiquetées par isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour la co-incubation avec les leucocytes humains et la contre-cellule subséquente avec un anticorps anti-FITC pour permettre la discrimination des conidies intériorisées et cellulaires. Les principaux avantages de ce protocole sont sa rapidité, la possibilité de combiner l’analyse avec l’analyse cytométrique d’autres marqueurs cellulaires d’intérêt, l’analyse simultanée des monocytes et des neutrophiles à partir d’un seul échantillon et son applicabilité à d’autres champignons ou bactéries muraux cellulaires. La détermination des pourcentages de phagocytosing leucocytes fournit un moyen aux microbiologistes pour évaluer la virulence d’un agent pathogène ou pour comparer les espèces pathogènes wildtypes et mutants ainsi qu’aux immunologistes pour étudier les capacités humaines de leucocyte pour combattre des agents pathogènes.
Introduction
L’aspergillose pulmonaire invasive est une grande menace pour les patients immunocompromis car les options de traitement sont limitées et seulement réussies sur le diagnostic tôt, qui mène aux taux élevés de mortalité1. Les agents infectieux sont des conidies (spores) de la moisissure Aspergillus fumigatus qui sont omniprésentes dans la plupart des habitats2. Les conidies sont inhalées, passent à travers les voies respiratoires et peuvent enfin entrer dans les alvéoles pulmonaires. Chez les humains immunocompétents, ces conidies sont éliminées par des cellules immunitaires innées telles que les monocytes ou les macrophages et les granulocytes neutrophiles, qui prennent (phagocytose) et digèrent les pathogènes3. La phagocytose est également importante pour les microbiologistes et les immunologistes lorsqu’elles s’intéressent aux interactions hôte-pathogène. Les essais de confrontation, tels que la co-incubation des leucocytes et des conidies, incluent souvent l’étiquetage des spores par fluorescein ou son isothiocyanate dérivé de fluorescein (FITC). À l’aide d’un microscope, il est simple d’identifier les conidies fluorescentes intériorisées et de déterminer les conidies attachées/adhérentes, bien que cette approche soit lourde et réalistement limitée à quelques centaines de cellules4. Cependant, dans la cytométrie de flux qui permet facilement l’analyse de centaines de milliers de cellules en quelques minutes, la coloration différentielle des conidies phagocytosed et adhérentes est essentielle. Par conséquent, de nombreux protocoles s’appuient sur Trypan Blue pour éteindre FITC-fluorescence de conidia adhérents5,6,7,8. Une autre approche consiste à exploiter le transfert d’énergie par résonance de fluorescence du bromure d’éhidium et du FITC pour émettre du rouge au lieu de la fluorescence verte des conidies adhérentes9,10,11. Si des anticorps spécifiques sont disponibles, comme c’est le cas pour certaines bactéries, les particules cellulaires peuvent être directement tachées12,13.
Ici, nous présentons un protocole pour évaluer rapidement et quantitativement la phagocytose des conidies A. fumigatus labeled DE FITC par les leucocytes humains avec l’attachement des spores aux cellules et le manque d’interaction en employant un anticorps anti-FITC allophycocyanin (APC) couplé. La méthode permet également l’analyse cytométrique simultanée d’autres marqueurs cellulaires qui peuvent être utilisés pour l’analyse séparée de la phagocytose par les monocytes et les neutrophiles du même échantillon.
Le protocole peut être appliqué pour la caractérisation des souches fongiques (par exemple, plusieurs espèces d’Aspergillus et d’autres moisissures du genre Mucorales présentés ici) et leurs mutants14 et la recherche immunologique sur les phagocytes, tels que les leucocytes des individus immunocompromis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente une méthode cytométrique à débit rapide pour mesurer l’interaction de A. fumigatus conidia avec un grand nombre de leucocytes humains primaires qui n’est pas possible dans les protocoles microscopiques communs. L’imagerie des cellules avec un microscope et le comptage manuel des conidies intériorisées est lourd et peut être fait de façon réaliste pour quelques centaines de cellules seulement. La cytométrie de flux surmonte ce problème en mesurant des milliers de cellules en quel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mme Pia Stier pour son excellente assistance technique. M. von Lilienfeld-Toal est soutenu par le Center for Sepsis Control and Care (Ministère fédéral allemand de l’éducation et de la santé, BMBF, FKZ 01E01002) et InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang est soutenu par l’École de communication microbienne de Jena (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
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