フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定
Summary
このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いたヒト一次食細胞によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの貪食を定量的に測定し、単なる接着から白血球へのコニジアの貪食を判別するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。
Abstract
カビアスペルギルス・フミガトゥスによる侵襲性肺感染は、免疫不全患者に大きな脅威をもたらす。吸入された真菌コニジア(胞子)は、先天性単球および/または好中球によって貪食されることによってヒト肺肺胞からクリアされる。このプロトコルは、ヒト白血球との共インキュベーションのためのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識コニディアを用いたフローサイトメトリーによるファゴサイトシスの迅速かつ信頼性の高い測定を提供し、その後の抗FITC抗体によるアンチステインを可能にし、内部および細胞付着性コニジアの判別を可能にする。このプロトコルの主な利点は、その急速さ、目的の他の細胞マーカーの細胞測定体分析とアッセイを組み合わせる可能性、単一のサンプルからの単球および好中球の同時分析および他の細胞壁を有する真菌または細菌への適用性である。食細胞の食細胞のパーセンテージの決定は、病原体の毒性を評価するための微生物学者や、病原体の野生型と突然変異体を比較するための手段を提供するだけでなく、病原体と戦うためにヒト白血球能力を調査するための免疫学者に提供する。
Introduction
侵襲性肺アスペルギルス症は、治療オプションが限られており、早期診断時にのみ成功し、高い死亡率につながる免疫不全患者にとって大きな脅威です。感染剤は、ほとんどの生息地にユビキタスである金型アスペルギルス・フミガトゥスのコニディア(胞子)である2.コニディアは吸入され、気道を通過し、最終的に肺肺胞に入ることができます。免疫能力の高いヒトにおいて、これらのコニディアは、単球またはマクロファージおよび好中球顆粒球などの自然免疫細胞によってクリアされ、これは病原体を取り込み(貪食)および消化する3である。食細胞症は、宿主と病原体の相互作用に興味を持つ微生物学者や免疫学者にとっても重要です。白血球およびコニジアの共インキュベーションのような対立アッセイは、しばしばフルオレセインまたはその誘導体フルオレセインイソチオシアネート(FITC)による胞子の標識を含む。顕微鏡を使用して、内部化された蛍光コニディアを識別し、付着/付着性のコニディアを決定するのは簡単ですが、このアプローチは面倒で現実的に数百個の細胞4に制限されています。しかし、数十万の細胞を数分以内に容易に分析できるフローサイトメトリーでは、食細胞および付着性コニジアの微分染色が不可欠である。したがって、多くのプロトコルは、付着コニディア5、6、7、8からFITC蛍光をクエンチするためにトリパンブルーに依存しています。別のアプローチは、付着コニディア9、10、11から緑色蛍光の代わりに赤色を放出するために臭化エチジウムおよびFITCの蛍光共鳴エネルギー移動を利用する。特定の抗体が利用可能な場合、一部の細菌の場合と同様に、細胞結合粒子は12、13に直接染色することができる。
ここでは、アロフィコシアニン(APC)結合抗FITC抗体を用いて、ヒト白血球によるFITC標識A.フミガトゥスコニジアの貪食を細胞への胞子の付着と相互作用の欠如と共に迅速かつ定量的に評価するプロトコルを提示する。この方法はまた、同じサンプルからの単球および好中球による食細胞症の別々の分析に使用することができるさらなる細胞マーカーの同時フローサイトメトリック分析を可能にする。
このプロトコルは、真菌系株(例えば、ここで提示されるムコラレ属からのいくつかの種のアスペルギルスおよび他の型)および免疫不全個体からの白血球などの食細胞に関する変異体14および免疫学的研究に適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、一般的な顕微鏡プロトコルでは不可能な多数の一次ヒト白血球とのA.フミガトゥス・コニディアの相互作用を測定する高速フローサイトメトリ法を提示する。顕微鏡で細胞をイメージングし、内部化されたコニディアを手動でカウントすることは面倒で、数百個の細胞に対してのみ現実的に行うことができます。フローサイトメトリーは、数分以内に数千の細胞を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ピア・スティエ夫人の優れた技術支援に感謝します。M. フォン・リリエンフェルト・トーアルは敗血症管理ケアセンター(ドイツ連邦教育保健省、BMBF、FKZ 01E01002)および感染性Gnostics研究キャンパス(BMBF、FKZ 13GW0096D)によってサポートされています。ティ・ゴック・マイ・ホアンは、イエナ・スクール・オブ・微生物通信(ドイツ・フォルシュチュンゲマイインシャフト、FKZ 214/2)によってサポートされています。
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
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