Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi
Summary
Bu protokol, aspergillus fumigatus conidia’nın fagositozunu akış sitometrisi kullanarak insan primer fagositler tarafından nicel olarak ölçmek ve konidianın fagositozunu sadece aparatlardan lökositlere ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
Abstract
Küf Aspergillus fumigatus tarafından invaziv pulmoner enfeksiyon bağışıklık hastaiçin büyük bir tehdit oluşturmaktadır. İnhale mantar konidia (sporlar) doğuştan gelen monositler ve/veya nötrofiller tarafından fagositosed olarak insan akciğer alveollerinden temizlenir. Bu protokol, insan lökositleri ile birlikte kuluçka için floresan izotiyoyanat (FITC) etiketli konidia ve daha sonra içselleştirilmiş ve hücre-yapışık konidia ayrımcılığına izin vermek için bir anti-FITC antikor ile sonraki karşı boyama kullanarak akış sitometri tarafından fagositoz hızlı ve güvenilir bir ölçüm sunuyor. Bu protokolün en önemli avantajları, hızlılığı, tahlilleri diğer şüpheli hücre belirteçlerinin sitometrik analizi ile birleştirme olasılığı, tek bir örnekteki monosit ve nötrofillerin eşzamanlı analizi ve diğer hücre duvar taşıyan mantar veya bakterilere uygulanabilirliğidir. Fagositasyon lökosityüzdelerinin belirlenmesi, bir patojenin virülansını değerlendirmek veya patojen yabani tipleri ve mutantları karşılaştırmak için mikrobiyologlara ve patojenlerle mücadele de insan lökosit yeteneklerini araştırmak için immünolojistlere bir araç sağlar.
Introduction
İnvaziv pulmoner aspergillosis, tedavi seçenekleri sınırlı ve sadece erken tanı da başarılı olduğu için immünazatlı hastalar için büyük bir tehdittir, bu da yüksek mortalite oranlarına yol açar1. Enfeksiyöz ajanlar çoğu habitat2 için her yerde olan küf Aspergillus fumigatus konidia(sporlar)vardır. Conidia solunduğunda, solunum yollarından geçer ve sonunda akciğer alveollerine girebilir. İmmün yetersiz insanlarda, bu konidia monositler veya makrofajlar ve nötrofil granülositler gibi doğuştan gelen bağışıklık hücreleri tarafından temizlenir, hangi (fagositoz) almak ve patojenleri sindirmek3. Fagositositaz, konak-patojen etkileşimleri ile ilgili olarak mikrobiyologlar ve immünolojistler için de önemlidir. Lökosit ve konidianın birlikte kuluçkaya yevdirilmesi gibi çatışma denemeleri genellikle floresan veya türevi floresan izotiyoyanat (FITC) ile sporların etiketlemesi içerir. Bir mikroskop kullanarak, bu yaklaşım hantal ve gerçekçi hücrelerin birkaç yüz sınırlı olmasına rağmen, içselleştirilmiş floresan konidia belirlemek ve ekli / yapışık konidibelirlemek için basittir4. Ancak, kolayca dakika içinde hücrelerin yüz binlerce analizini sağlayan akış sitometrisinde, fagositositve yapışık konidianın diferansiyel boyanması hayati önem taşır. Bu nedenle, birçok protokoller adherentconidia5,6,7,8FITC-floresan söndürmek için Trypan Mavi güveniyor. Başka bir yaklaşım yapışık conidia9,10,11yeşil floresan yerine kırmızı yaklamak ethidyum bromür ve FITC floresan rezonans enerji transferi istismar olduğunu . Belirli antikorlar varsa, bazı bakteriler için olduğu gibi, hücrebağlı parçacıklar doğrudan lekeli olabilir12,13.
Burada, insan lökositler tarafından FITC etiketli A. fumigatus conidia fagositozunun hızlı ve nicel olarak değerlendirilmesi için bir protokol sunmaktayız ve sporların hücrelere bağlanması ve allofikocyanin (APC) birleştirilmiş anti-FITC antikorkullanılarak etkileşim eksikliği. Bu yöntem aynı örnekten monositler ve nötrofiller tarafından fagositözayrı analizi için istihdam edilebilir diğer hücre belirteçleri eşzamanlı akış sitometrik analizi için izin verir.
Protokol, mantar suşlarının (örneğin, burada mucorales cinsinden çeşitli Aspergillus türleri ve diğer kalıpların) ve mutantların14 ve fagositler üzerinde immünolojik araştırmaları, örneğin immünazatlı bireylerden lökositler gibi karakterizasyonu için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, a. fumigatus conidia’nın çok sayıda birincil insan lökositi ile etkileşimini ölçmek için hızlı bir akış sitometrik yöntemi ni sunar ve bu yöntem ortak mikroskobik protokollerde mümkün değildir. Bir mikroskop ile görüntüleme hücreleri ve elle içselleştirilmiş konidia sayma hantal ve gerçekçi sadece birkaç yüz hücreleri için yapılabilir. Akış sitometrisi bu sorunun üstesinden birkaç dakika içinde binlerce hücreyi ölçerek giderilir. Her iki yaklaşımda da yaygın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bayan Pia Stier’e mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz. M. von Lilienfeld-Toal, Sepsis Kontrol ve Bakım Merkezi (Almanya Federal Eğitim ve Sağlık Bakanlığı, BMBF, FKZ 01E01002) ve InfectoGnostik Araştırma Kampüsü (BMBF, FKZ 13GW0096D) tarafından desteklenir. Thi Ngoc Mai Hoang Jena Mikrobiyal İletişim Okulu (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2) tarafından desteklenir
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
