Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry
Summary
Questo protocollo fornisce un metodo veloce e affidabile per misurare quantitativamente la fagocitosi di Aspergillus fumigatus conidia da fagociti primari umani utilizzando la citometria di flusso e per discriminare la fagocitosi di conidia dalla mera adesione ai leucociti.
Abstract
L’infezione polmonare invasiva da parte dello stampo Aspergillus fumigatus rappresenta una grande minaccia per i pazienti immunocompromessi. Le conidia fungine inalate (spore) vengono eliminate dagli alveoli polmonari umani per essere fagocitosed da monociti innati e/o neutrofili. Questo protocollo offre una misurazione rapida e affidabile della fagocitosi mediante citometria di flusso utilizzando conidia con etichettatura fitC (isotonionnate) con etichettatura fitC (FITC) per la co-incubazione con leucociti umani e la successiva controtendenza con un anticorpo anti-FITC per consentire la discriminazione dei conerentidi internalizzati e addicenti delle cellule. I principali vantaggi di questo protocollo sono la sua rapidità, la possibilità di combinare l’analisi con l’analisi citometrica di altri marcatori cellulari di interesse, l’analisi simultanea di monociti e neutrofili da un singolo campione e la sua applicabilità ad altri funghi o batteri che portano la parete cellulare. La determinazione delle percentuali di fagocitosi sui leucociti fornisce un mezzo ai microbiologi per valutare la virulenza di un agente patogeno o per confrontare patogeni tipi selvatici e mutanti, nonché con gli immunologi per studiare le capacità di leucociti umani per combattere gli agenti patogeni.
Introduction
L’aspergillosi polmonare invasiva è una grande minaccia per i pazienti immunocompromessi in quanto le opzioni di trattamento sono limitate e hanno successo solo dopo la diagnosi precoce, il che porta ad alti tassi di mortalità1. Gli agenti infettivi sono conidia (spore) dello stampo Aspergillus fumigatus che sono onnipresenti per la maggior parte degli habitat2. I Conidia vengono inalati, passano attraverso le vie aeree e possono finalmente entrare negli alveoli polmonari. Negli esseri umani immunocompetenti, queste conidie vengono eliminate da cellule immunitarie innate come monociti o macrofagi e granulociti neutrofili, che assumono (fagocitosi) e digeriscono gli agenti patogeni3. La fagocitosi è importante per i microbiologi e gli immunologi allo stesso modo quando sono interessati alle interazioni ospite-patogeno. I saggi di confronto, come la co-incubazione di leucociti e conidi, spesso includono l’etichettatura delle spore da fluoresceina o dalla sua fluoresceina derivata isothiocyanate (FITC). Utilizzando un microscopio, è semplice identificare conidia fluorescente interiorizzata e determinare la conidia collegata / aderente, anche se questo approccio è ingombrante e realisticamente limitato a poche centinaia di cellule4. Tuttavia, nella citometria di flusso che consente facilmente l’analisi di centinaia di migliaia di cellule in pochi minuti, la colorazione differenziale di conidia fagocitosa e aderente è vitale. Pertanto, molti protocolli si basano su Trypan Blue per dissetare FITC-fluorescenza da aderente conidia5,6,7,8. Un altro approccio è lo sfruttamento del trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza di bromuro di etidio e FITC per emettere rosso invece di fluorescenza verde da aderente conidia9,10,11. Se sono disponibili anticorpi specifici, come nel caso di alcuni batteri, le particelle legate alle cellule possono essere macchiate direttamente12,13.
Qui, presentiamo un protocollo per valutare rapidamente e quantitativamente la fagocitosi di A. fumigatus conidia con ileuciti umani insieme all’attaccamento delle spore alle cellule e alla mancanza di interazione utilizzando un anticorpo anti-FITC accoppiato all’allocazione (APC). Il metodo consente anche l’analisi citometrica a flusso simultaneo di ulteriori marcatori cellulari che possono essere impiegati per l’analisi separata della fagocitosi da monociti e neutrofili dello stesso campione.
Il protocollo può essere applicato per la caratterizzazione dei ceppi fungini (ad esempio, diverse specie di Aspergillus e altri stampi del genere Mucorales qui presentati) e dei loro mutanti14 e ricerca immunologica sui fagociti, come i leucociti da individui immunocompromessi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo presenta un metodo citometrico a flusso rapido per misurare l’interazione di A. fumigatus conidia con un gran numero di leucociti umani primari che non è possibile nei protocolli microscopici comuni. L’imaging delle cellule con un microscopio e il conteggio manuale delle conidie interiorizzate sono ingombranti e possono realisticamente essere eseguite solo per alcune centinaia di cellule. La citometria di flusso supera questo problema misurando migliaia di cellule in pochi minuti. Un ostacolo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la signora Pia Stier per l’eccellente assistenza tecnica. M. von Lilienfeld-Toal è supportato dal Center for Sepsis Control and Care (Ministero federale tedesco dell’istruzione e della salute, BMBF, FK, FK, 01E01002) e dal campo di ricerca InfectoGnostics (BMBF, FK-13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang è supportato dalla Jena School of Microbial Communication (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FK 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
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