الاستفادة من التعكر والتصوير التخثري لتوصيف الجلطات التكميلية
Summary
فيبرين هو المسؤول عن تشكيل جلطة خلال الهباس والجلطات. يمكن استخدام المقايسات العكرة والجلطات (TEG) كأدوات تآزرية توفر تقييمًا تكميليًا للجلطة. يمكن لهذه التقنيات اثنين معا إعطاء مزيد من البصيرة في كيفية تأثير ظروف التخثر تشكيل جلطة الفيبرين.
Abstract
الجلطة هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. فيبرين (ogen) هو البروتين المسؤول في المقام الأول عن تشكيل الجلطة أو تجلط الدم. ولذلك، وصف تشكيل جلطة الفيبرين مفيد لدراسة تجلط الدم. يتم استخدام العكرة والجلطات (TEG) على نطاق واسع في المختبرات لرصد تشكيل الجلطة. التعكر يقيس بشكل حيوي الإرسال الضوء من خلال هيكل جلطة الليفين عن طريق مطياف وغالبا ما تستخدم في مختبرات البحوث. TEG هي تقنية اللزجة المتخصصة التي تقيس قوة تجلط الدم مباشرة وتستخدم في المقام الأول في البيئات السريرية لتقييم الهزى المرضى. مع مساعدة من هاتين الادوات, هذه الدراسة يصف طريقة لتميز جلطة في المختبر في المختبر باستخدام نموذج مبسطة الجلطات الفيبرينوجين / ثرومبين. وقد تمت مقارنة اتجاهات البيانات عبر كلتا التقنيتين في ظل ظروف تخثر مختلفة. تشكلت جلطات الفينة البشرية والبفينة جنبًا إلى جنب في هذه الدراسة حيث تستخدم عوامل تخثر البقر غالبًا كبدائل لعوامل التخثر البشرية في البيئات السريرية والبحثية. تظهر النتائج أن TEG والعكارة تتبع تشكيل جلطة عبر طريقتين متميزتين وعندما تستخدم معا توفير قوة جلطة تكميلية والألياف المعلومات الهيكلية عبر ظروف تخثر متنوعة.
Introduction
تجلط الدم هو التكوين المرضي لجلطات الدم في الجسم التي تمنع الدورة الدموية مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. هناك 1 إلى 2 حالات من الجلطات الدموية الوريدية و 2 إلى 3 حالات من أمراض الأوعية الدموية الناجمة عن الجلطات لكل 1000 شخص سنويا1،2. هنا هو طريقة الاستفادة من الجلطات (TEG) والعكر لرصد تشكيل جلطة تحت ظروف تخثر مختلفة. فيبرين (ogen) هو البروتين الأساسي المسؤول عن تشكيل الجلطة في الجسم. في الخطوات النهائية من تتالي التخثر ، يتم شقوق الفيبرينوبيتيدات من الفيبرينوجين عن طريق ثرومبين بدء البلمرة من مونومرات الفيبرين غير قابلة للذوبان كما تطور الجلطة3،4. لفهم تشكيل الجلطة في تجلط الدم المرضي ، من الضروري توصيف تكوين الفيبرين في ظل ظروف تخثر متنوعة. وقد استخدمت عدة جلطة الرصد المقايسة لدراسة تشكيل جلطة الفيبرين في المختبر. Prothrombin الوقت (PT / INR) وتنشيط جزء من تخثر الوقت (aPTT) هما اختبار السريرية المشتركة التي تقيس سلامة مسار تخثر محددة. ومع ذلك، فإنها تستخدم الوقت باعتبارها المتغير الوحيد الذي لا يعطي أي إشارة إلى خصائص جلطة فيزيائية5. المجهر الإلكتروني يسمح التصور من البنية الدقيقة لجلط الفيبرين شكلت تماما ولكن لا يوفر أي معلومات عن عملية تشكيل جلطة نفسها6. من بين جميع المقايسات ، تقدم مقايسات التعكر و TEG القدرة على تتبع خصائص الجلطة ديناميكيًا مع مرور الوقت. هذه التقنيات تمكن من قياس شامل تخثر الملامح ، وبالتالي ، وتوفير بعض الفائدة على غيرها من أدوات توصيف تجلط الفيبرين.
على وجه التحديد، تستخدم على نطاق واسع لم مقايسات التعكر (أو تجلط) للبحث والتطبيقات السريرية بسبب تطبيقه التبسيطي وسهولة الوصول إلى مطياف في مختبرات البحوث. هذه المقاييس تسمح بقياس ديناميكي لـ إحالة الضوء من خلال جلطة تشكيلية من خلال أخذ قراءات متكررة فردية في طول موجة محدد (الأكثر شيوعًا عند طول الموجة في نطاق 350 – 700 نانومتر)7. ويمكن أيضا أن تكون درجة الحرارة في غرفة القراءة تعديلها. كما شكل هلام الفيبرين, يتم تقليل كمية الضوء الذي ينتقل من خلال شبكة البروتين مما تسبب في زيادة في امتصاص مع مرور الوقت. وبالمثل، يقلل الامتصاص عندما تتحلل شبكة الجلطة. يمكن بسهولة أن تكون مقايسات التعكر متعددة باستخدام تنسيق لوحة متعددة البئر للسماح لفحص عينة عالية الإنتاجية في كل من 96 – و 384-جيدا لوحات. يمكن اشتقاق العديد من خصائص الجلطة من منحنى تتبع التعكر (الامتصاص على قياس الوقت) التي تشمل: التعكر الأقصى، والوقت إلى أقصى عكرة، والوقت لتجلط بداية، ومعدل تشكيل جلطة (Vmax). ويمكن أيضا أن تستمد نسبة الألياف الفيبرين/ طول من البيانات التعكر الخام لتقدير سمك الألياف الفيبرين8,9,10.
يستخدم TEG في المقام الأول في الإعداد السريري لتقييم المرضى ‘الهزات وجلط. كما أنها تستخدم عادة في التطبيقات الجراحية لتحديد متى الأدوية المضادة للfibrinolytic أو منتجات الدم hemostatic ينبغي أن تدار11,12. يحدث تشكيل الجلطات داخل كوب TEG مع إضافة جميع مكونات التخثر إلى الكأس قبل بدء الفحص. الكأس، مع جلطة متطورة، يدور جسديا ضد دبوس الذي يتم إدراجه في مركزه وجهاز استشعار التواء الكهروميكانيكية يقيس قوة اللزوجة المتزايدة من جلطة. ويتم هذا الفحص عادة في درجة الحرارة الفسيولوجية من 37 درجة مئوية; ومع ذلك، يمكن ضبط درجة الحرارة يدويا على الصك. السعة القصوى (MA) ، ومعدل التفاعل (R) ، ووقت الحركة (K) ، وα – زاوية (زاوية) ، والوقت إلى أقصى سعة (TMA) يتم استخراجها من قبل برنامج TEG من تتبع TEG الديناميكي. وعادة ما تقارن هذه القيم مع النطاقات السريرية الطبيعية لتقييم حالة تخثر المريض. في حين TEG ليست على وجه التحديد فيزيتروم، كما أنها تقيس قوة جلطة في وحدات ملليمتر، فإنه لا توفر البيانات الهامة جلطة فيزيلاستيك ووظائف كأداة قيمة صنع القرار السريري للأطباء لاتخاذ قرار لإدارة منتجات الدم محددة وضبط الجرعات العلاجية13. عندما يتم استخدام كل من TEG وتكديرية مع بعضها البعض، فإنها توفر معلومات تكميلية توصيف جلطة وقوة جلطة ويتم استخراجها بسهولة من TEG وسمك الألياف الفيبرين يمكن الوصول إليها عن طريق قياسات التعكر البصرية.
كما الفيبرين هو عنصر حاسم في تجلط الدم, توصيف تجلط فيبرين في ظل ظروف تشكيل جلطة متنوعة يمكن أن توفر رؤية قيمة في كيفية متغير معين يساهم في عملية تشكيل جلطة والخصائص النهائية جلطة. يمكن أن يوفر فهم هذا التوجيه لتشخيص الخثار وتطوير العلاجات. للحصول على توصيف جلطة الفيبرين أكثر تمثيلا، يمكن استبدال البلازما لرصد تشكيل جلطة كما يشبه في ظروف تخثر الجسم الحي بشكل أوثق من نظام نموذج الفبرينوجين / ثرومبين مبسطة. ومع ذلك ، نظرًا للطبيعة المعقدة لسلسلة التخثر ، فإن تشكيل الجلطات باستخدام البلازما يزيد من تعقيدها ، مما يجعل من الصعب عزل تأثير العوامل الفردية. استخدام نموذج مبسطة الفيبرينوجين / ثرومبين يمنع الحاجة إلى بدء تتالي تخثر كامل مما يسمح لعزل الخطوة النهائية تشكيل الفيبرين. من خلال تضمين اثنين من مكونات تشكيل الفيبرين الرئيسية (الفيبرينوجين والثرومبين)، هذا الإعداد يخلق حالة تكوين جلطة تسيطر عليها للغاية. من المهم أيضا أن نلاحظ أنه في حين يتم استخدام نموذج الجلطة المبسطة هنا، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتوصيف الجلطات أكثر تعقيدا من خلال تضمين عوامل تخثر إضافية. في هذه الدراسة، يتم تنفيذ توصيف تجلط الفيبرين باستخدام العكرة و TEG من قبل تركيزات مختلفة من الفيبرينوجين والثرودة، والقوة الأيونية، والدرجات والدرجات الرئوية، وتركيز البروتين الكلي في محلول التخثر لمحاكاة مختلف في ظروف تخثر الجسم الحي14. وقد أدرجت في القسم 5 تفاصيل تتعلق بهذه الاختلافات في البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح هذا البروتوكول استخدام أداتين توصيفي جلطات مميزة اختبار نموذج مبسط لتخثر الفيبرينوجين/الجلطات باستخدام المكونات المتاحة تجارياً. كل من TEG وتكدر من السهل إجراء. أنها لا توفر فقط فحص نقطة النهاية جلطة مثل تشكيل الحد الأقصى جلطة (ماكسTurb و TEGماكس)وأوقات تشكيل جلطة(وقت Tur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural origins of fibrin clot rheology. Biophysical Journal. 77 (5), 2813-2826 (1999).
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. . Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. . The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
