Tirer parti de la turbidité et de la thromboélastographie pour la caractérisation complémentaire des caillots
Summary
La fibrine est responsable de la formation de caillots pendant l’hémostase et la thrombose. Les tests de turbidité et thromboelastograhy (TEG) peuvent être utilisés comme outils synergiques qui fournissent une évaluation complémentaire d’un caillot. Ces deux techniques ensemble peuvent donner plus de perspicacité dans la façon dont les conditions de coagulation affectent la formation de caillots de fibrine.
Abstract
La thrombose est l’une des principales causes de décès dans le monde. La fibrine(ogen) est la protéine principalement responsable de la formation de caillots ou de la thrombose. Par conséquent, caractériser la formation de caillots de fibrine est bénéfique à l’étude de la thrombose. La turbidité et la thromboélastographie (TEG) sont toutes deux largement utilisées dans les tests in vitro pour surveiller la formation de caillots. La turbidité mesure dynamiquement la transmission de la lumière à travers une structure de caillot de fibrine via un spectromètre et est souvent utilisée dans les laboratoires de recherche. Teg est une technique viscoélastique spécialisée qui mesure directement la force des caillots sanguins et est principalement utilisée en milieu clinique pour évaluer l’hémostase des patients. À l’aide de ces deux outils, cette étude décrit une méthode de caractérisation d’un caillot de fibrine in vitro à l’aide d’un modèle simplifié de caillot de fibrinogène/thrombine. Les tendances des données dans les deux techniques ont été comparées dans diverses conditions de coagulation. Des caillots de fibrine humain et bovin ont été formés côte à côte dans cette étude, car les facteurs de coagulation bovine sont souvent utilisés comme substituts aux facteurs de coagulation humaine dans les milieux cliniques et de recherche. Les résultats démontrent que le TEG et la formation de caillots de trajectoire de turbidité par l’intermédiaire de deux méthodes distinctes et lorsqu’ils sont utilisés ensemble fournissent la force complémentaire de caillot et l’information structurelle de fibre dans diverses conditions de coagulation.
Introduction
La thrombose est la formation pathologique d’un caillot sanguin dans le corps qui bloque la circulation sanguine conduisant à une morbidité et une mortalité élevées dans le monde entier. Il y a 1 à 2 cas de thromboembolie veineuse et 2 à 3 cas de maladies vasculaires induites par la thrombose pour 1000 personnes par an1,2. Présenté ici est une méthode de mise à profit de la thromboélastographie (TEG) et la turbidité pour surveiller la formation de caillots dans diverses conditions de coagulation. Fibrin(ogen) est la protéine primaire qui est responsable de la formation de caillots dans le corps. Dans les dernières étapes de la cascade de coagulation, les fibrinopeptides sont fendus du fibrinogène par la thrombine initiant la polymérisation des monomères de fibrine insolubles que le caillot se développe3,4. Pour comprendre la formation de caillot dans la thrombose pathologique, il est nécessaire de caractériser la formation de fibrine dans diverses circonstances de coagulation. Des tests multiples de surveillance des caillots ont été utilisés pour étudier la formation de caillots de fibrine in vitro. Le temps de prothrombine (PT/INR) et le temps partiel activé de thromboplastine (aPTT) sont deux essais cliniques communs qui mesurent l’intégrité d’une voie spécifique de coagulation. Cependant, ils utilisent le temps comme la seule variable qui ne donne aucune indication des propriétés physiques de caillot5. La microscopie électronique permet la visualisation de la micro-structure d’un caillot de fibrine complètement formé, mais ne fournit aucune information sur le processus de formation du caillot lui-même6. Parmi tous les tests, les tests de turbidité et teg offrent la capacité de suivre dynamiquement les caractéristiques des caillots au fil du temps. Ces techniques permettent la mesure des profils complets de coagulation et, par conséquent, fournissent un certain avantage par rapport à d’autres outils de caractérisation des caillots fibrine.
Plus précisément, les tests de turbidité (ou turbidimétrie de caillot) sont largement utilisés pour la recherche et les applications cliniques en raison de sa mise en œuvre simpliste et de la grande accessibilité des spectromètres dans les laboratoires de recherche. Ce test permet une mesure dynamique de la transmission de la lumière par un caillot formant en prenant des lectures répétitives individuelles à une longueur d’onde définie (le plus souvent à une longueur d’onde dans la gamme de 350 – 700 nm)7. La température dans la chambre de lecture peut également être ajustée. À mesure que le gel fibrine se forme, la quantité de lumière qui circule dans le réseau protéique est réduite, ce qui entraîne une augmentation de l’absorption au fil du temps. De même, l’absorption diminue lorsque le réseau de caillots se dégrade. Les tests de turbidité peuvent facilement être multiplexés à l’aide d’un format de plaque multi-puits pour permettre un dépistage à haut débit dans les plaques de 96 et 384 puits. Plusieurs caractéristiques de caillot peuvent être dérivées d’une courbe de traçage de turbidité (absorption au fil du temps) qui incluent : turbidité maximale, temps à turbidité maximale, temps pour le début de caillot, et taux de formation de caillot (Vmax). Un rapport masse/longueur de fibre de fibrine peut également être dérivé des données brutes de turbidité pour estimer l’épaisseur de fibre de fibrine8,9,10.
Teg est principalement utilisé dans le cadre clinique pour évaluer l’hémostase des patients et la lyse de caillot. Il est également couramment utilisé dans les applications chirurgicales pour déterminer quand les médicaments anti-fibrinolytiques ou les produits sanguins hémostatiques doivent être administrés11,12. La formation de caillots se produit à l’intérieur d’une tasse teg avec tous les composants de coagulation étant ajouté à la tasse avant le début de l’essai. La tasse, avec un caillot en évolution, tourne physiquement contre une goupille qui est insérée dans son centre et un capteur de torsion électromécanique mesure la force viscoélastique croissante du caillot. Ce test est généralement effectué à la température physiologique de 37 °C; toutefois, la température peut être ajustée manuellement sur l’instrument. L’amplitude maximale (MA), la vitesse de réaction (R), le temps cinétique (K), l’angle α (angle) et le temps jusqu’à l’amplitude maximale (TMA) sont extraits par le logiciel TEG du traçage teg dynamique. Ces valeurs sont généralement comparées aux gammes normales cliniques pour évaluer l’état de coagulation d’un patient. Bien que teg n’est pas précisément un viscomètre, car il mesure la force des caillots en unités millimétriques, il fournit des données importantes sur les caillots viscoélastiques et fonctionne comme un outil de prise de décision clinique précieux pour les médecins de décider d’administrer des produits sanguins spécifiques et ajuster le dosage thérapeutique13. Lorsque les essais de TEG et de turbidité sont utilisés ensemble, ils fournissent des informations complémentaires de caractérisation des caillots que la force du caillot et la cinétique sont facilement extraites de l’épaisseur de la fibre de TEG et fibrine peut être consulté par des mesures de turbidité optique.
Comme la fibrine est un composant critique d’un caillot de sang, la caractérisation des caillots fibrine dans diverses conditions de formation de caillots peut fournir un aperçu précieux de la façon dont une variable spécifique contribue au processus de formation des caillots et aux propriétés ultimes du caillot. Comprendre cela peut fournir des conseils pour le diagnostic de thrombose et le développement de la thérapeutique. Pour obtenir une caractérisation plus représentative des caillots de fibrine, le plasma peut être substitué pour surveiller la formation de caillots, car il ressemble plus étroitement aux conditions de coagulation in vivo qu’un système simplifié de modèle fibrinogène/thrombine. Cependant, en raison de la nature complexe de la cascade de coagulation, la formation de caillots à l’aide de plasma ajoute à la complexité, ce qui rend plus difficile d’isoler l’impact des facteurs individuels. L’utilisation d’un modèle simplifié fibrinogène/thrombine empêche la nécessité d’initier toute la cascade de coagulation permettant l’isolement de l’étape finale de formation de fibrine. En incluant deux composants majeurs de formation de fibrine (fibrinogène et thrombine), cette configuration crée une condition de formation de caillot très contrôlée. Il est également important de noter que bien que le modèle simplifié de caillot soit utilisé ici, ce protocole peut également être utilisé pour caractériser des caillots plus complexes en incluant des facteurs de coagulation supplémentaires. Dans cette étude, la caractérisation des caillots fibrines à l’aide de la turbidité et du TEG est effectuée par des concentrations variables de fibrinogène et de thrombine, de la force ionique, du pH et de la concentration totale de protéines dans la solution de coagulation pour imiter différentes circonstances de coagulation in vivo14. Les détails concernant ces variations du protocole ont été inclus à la section 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole démontre l’utilisation de deux outils distincts de caractérisation des caillots qui testent un modèle simplifié de caillots de fibrinogène/thrombine à l’aide de composants disponibles dans le commerce. Les tests de TEG et de turbidité sont faciles à réaliser. Ils fournissent non seulement des examens de caillot de point final tels que la formation maximale de caillot (TurbMax et TEGMax)et les temps de formation de caillots (TurbTime et TEGTime)mais év…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
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