מינוף טורבידיות וטרומבולסטוגרפיה לאפיון קרישי דם משלימים
Summary
פיברין אחראי על היווצרות קריש במהלך המוסטאזיס ופקקת. אסמים סוערים וhromboelastograhy (TEG) יכול להיות מנוצל ככלים סינרגטיים המספקים הערכה משלימה של קריש דם. שתי טכניקות אלה יחד יכולות לתת תובנה נוספת כיצד תנאי קרישה משפיעים על היווצרות קריש פיברין.
Abstract
פקקת היא סיבת מוות מובילה ברחבי העולם. פיברין (אוגן) הוא החלבון האחראי בעיקר על היווצרות קריש דם או פקקת. לכן, אפיון היווצרות קריש פיברין הוא מועיל לחקר פקקת. טורבידיות וטרומבולסטוגרפיה (TEG) הן שניהם מנוצלים באופן נרחב במבחנה אסרות לניטור היווצרות קריש. Turbidity מודד באופן דינמי את העברת האור באמצעות מבנה קריש פיברין באמצעות ספקטרומטר והוא משמש לעתים קרובות במעבדות מחקר. TEG היא טכניקה ויסקולסטית מיוחדת המודדת ישירות את עוצמת קריש הדם והוא מנוצל בעיקר בהגדרות קליניות כדי להעריך את המוסטאזיס של המטופלים. בעזרת שני כלים אלה, מחקר זה מתאר שיטה לאפיון קריש דם במבחנה פיברין באמצעות מודל קרישי פיברינוגן/טרומבין פשוט. מגמות נתונים על פני שתי הטכניקות הושוו בתנאי קרישה שונים. קרישי פיברין אנושיים ובצק נוצרו זה לצד זה במחקר זה כמו גורמי קרישת בקרישת בקר משמשים לעתים קרובות כתחליף גורמי קרישה אנושיים בהגדרות קליניות ומחקר. התוצאות מוכיחות כי TEG ו- turbidity לעקוב אחר היווצרות קריש דם באמצעות שתי שיטות נפרדות וכאשר מנוצל יחד לספק כוח קריש משלים ומידע מבני סיבים על פני תנאי קרישה מגוונים.
Introduction
פקקת היא היווצרות פתולוגית של קריש דם בגוף שחוסם את זרימת הדם המובילה לתמולות ותמותה גבוהות ברחבי העולם. ישנם 1-2 מקרים של פקקת ורידים ו 2-3 מקרים של פקקת המושרה מחלות כלי דם לכל 1000אנשים מדי שנה 1,,2. מוצג כאן היא שיטה מינוף טרומבולסטוגרפיה (TEG) וטורביות כדי לפקח על היווצרות קריש תחת תנאי קרישה שונים. פיברין (אוגן) הוא החלבון העיקרי האחראי על היווצרות קריש דם בגוף. בשלבים האחרונים של מפל קרישה, פיברינופטידים הם קצוצים פיברינוגן על ידי טרומבין ייזום הפולימר של מונומרים פיברין מסיסים כמו קרישמפתחת 3,,4. כדי להבין היווצרות קריש ים בפקקת פתולוגית, יש צורך לאפיין היווצרות פיברין בנסיבות קרישה מגוונות. מספר ניטור קרישים נעשה שימוש כדי ללמוד היווצרות קריש פיברין במבחנה. זמן פרותרומבין (PT/INR) וזמן טרומבופלסטיקן חלקי פעיל (aPTT) הם שני נושאים קליניים נפוצים המודדים את השלמות של מסלול קרישה ספציפי. עם זאת, הם משתמשים בזמן כמשתנה היחיד שלא נותן שום אינדיקציה של תכונות קריש פיזי5. מיקרוסקופאלקטרונים מאפשר הדמיה של המיקרו-מבנה של קריש פיברין שנוצר לחלוטין, אך אינו מספק מידע על תהליך יצירת הקריש עצמו6. בין כל ההתבטאויות, ההתבטאות הסוערת וה-TEG מציעות את היכולת לעקוב אחר מאפייני קריש דם באופן דינמי לאורך זמן. טכניקות אלה מאפשרות מידה של פרופילי קרישה מקיפים ולכן, לספק תועלת מסוימת על פני כלים אחרים אפיון קריש פיברין.
באופן ספציפי, תקרת טורבידיות (או turbidimetry קריש) משמש נרחב עבור מחקר ויישומים קליניים בשל הטמעתו פשטנית ואת הנגישות הרחבה של ספקטרומטרים במעבדות מחקר. אסייד זה מאפשר מדידה דינמית של שידור אור באמצעות קריש דם יוצר על ידי לקיחת קריאות חוזרות בודדות באורך גל מוגדר (הנפוץ ביותר באורך גל בטווח של 350 – 700 נק’)7. ניתן גם להתאים את הטמפרטורה בתא הקריאה. כמו צורות ג’ל פיברין, כמות האור שעובר דרך רשת החלבון מופחתת גורם לעלייה בספיגה לאורך זמן. באופן דומה, הספיגה פוחתת כאשר רשת הקרישים מתדרדרת. ניתן בקלות לבצע את ההכפלה של Turbidity באמצעות תבנית צלחת מרובת בארות כדי לאפשר הקרנה של מדגם תפוקה גבוהה הן ב-96 ו-384 בארות. מספר מאפייני קריש ניתן לגזור עקומת מעקב turbidity (ספיגה לאורך מדידת זמן) הכוללים: מערבולת מקסימלית, זמן למערבולת מקסימלית, זמן לתחילת קריש, וקצב היווצרות קריש (Vmax). יחס מסה/אורך סיב פיברין יכול גם להיות נגזר מנתוני מערבולת גולמית כדי להעריךעובי סיבים פיברין 8,9,10.
TEG מנוצל בעיקר בסביבה הקלינית כדי להעריך את ההמוסטזיס של המטופלים ואת הליזה קריש. הוא משמש גם ביישומים כירורגיים כדי לקבוע מתי תרופות אנטי-פיברינוליטיות או מוצרי דם המוסאטיים צריך להינתן11,,12. היווצרות קריש מתרחשת בתוך TEG עם כל רכיבי קרישת ההתווספו לספל לפני החניכה של ההסתה. הספל, עם קריש דם מתפתח, מסתובב פיזית כנגד סיכה המוכנסת למרכזה וחיישן פיתול אלקטרומכני מודד את הכוח ההולך וגדל של הקריש. אסייפ זה מתבצע בדרך כלל בטמפרטורה הפיזיולוגית של 37 °C; עם זאת, ניתן לכוונן את הטמפרטורה באופן ידני על המכשיר. משרעת מקסימלית (MA), קצב תגובה (R), זמן קינטיקה (K), α-זווית (זווית) וזמן למשרעת מקסימלית (TMA) מופקים על-ידי תוכנת TEG ממעקב TEG דינמי. ערכים אלה מושווים בדרך כלל עם טווחים נורמליים קליניים כדי להעריך את מצב קרישה של המטופל. בעוד TEG הוא לא בדיוק viscometer, כפי שהוא מודד כוח קריש ביחידות מילימטר, זה מספק נתוני קריש ויסות ופונקציות חשובות ככלי קבלת החלטות קליניות יקרות ערך עבור רופאים להחליט לנהל מוצרי דם ספציפיים ולהתאים מינוןטיפולי 13. כאשר הן TEG והן מערבולת assays מנוצלים יחד, הם מספקים מידע אפיון קריש משלים כמו כוח קריש קינטיקה מופקים בקלות מ TEG ועובי סיבים פיברין ניתן לגשת על ידי מדידות turbidity אופטי.
כמו fibrin הוא מרכיב קריטי של קריש דם, אפיון קריש פיברין בתנאים מגוונים היווצרות קריש יכול לספק תובנה חשובה כיצד משתנה מסוים תורם לתהליך היווצרות קריש ומאפייני קריש דם האולטימטיבי. הבנת זה יכול לספק הדרכה לאבחון פקקת ופיתוח של טיפולית. כדי להשיג אפיון קריש פיברין מייצג יותר, פלזמה ניתן להחליף כדי לפקח על היווצרות קריש כפי שהוא דומה בתנאי קרישת vivo יותר מקרוב מאשר מערכת מודל פיברינוגן/ טרומבין פשוטה. עם זאת, בשל האופי המורכב של מפל קרישה, היווצרות קריש באמצעות פלזמה מוסיף למורכבות, מה שהופך את זה קשה יותר לבודד את ההשפעה של גורמים בודדים. שימוש במודל פיברינוגן/טרומבין פשוט מונע את הצורך ליזום את כל מפל הקרישה המאפשר בידוד של שלב היווצרות פיברין הסופי. על ידי הכללת שני רכיבים עיקריים ליצירת פיברין (פיברינוגן ותרומבין), התקנה זו יוצרת מצב היווצרות קריש מבוקר מאוד. חשוב גם לציין כי בעוד מודל קרישי דם פשוטה משמש כאן, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לאפיין קרישי דם מורכבים יותר על ידי הכללת גורמי קרישה נוספים. במחקר זה, אפיון קריש פיברין באמצעות turbidity ו TEG מתבצעים על ידי ריכוזי פיברינוגן ותרומבין שונים, כוח יוני, pH, וריכוז חלבון כולל בתמיסת קרישה לחקות שונה בנסיבות קרישת vivo14. פרטים אודות וריאציות אלה בפרוטוקול נכללו בסעיף 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מדגים את הניצול של שני כלים ייחודיים לאפיון קרישי דם בדיקת מודל קרישי פיברינוגן/טרומבין פשוט באמצעות רכיבים זמינים מסחרית. גם TEG וגם אסות טורביות קלות להתנהלות. הם לא רק מספקים בדיקות קריש קצה כגון היווצרות קריש מרבי (TurbTime Max ו TEGMax)וזמן היווצרות קריש דם (זמן טור…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אף לא אחד .
Materials
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural origins of fibrin clot rheology. Biophysical Journal. 77 (5), 2813-2826 (1999).
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. . Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. . The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
