보완 응고 특성화를 위한 탁도 및 혈전 성형술 활용
Summary
피브린은 혈전증과 혈전증 중 응고 형성에 책임이 있습니다. 탁도 검사 및 혈전(TEG)은 응고의 보완적인 평가를 제공하는 시너지 도구로 활용할 수 있다. 이 두 가지 기술은 응고 조건이 피브린 응고 형성에 미치는 영향에 대한 더 많은 통찰력을 줄 수 있습니다.
Abstract
혈전증은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 피브린(ogen)은 혈전 형성 또는 혈전증을 주로 담당하는 단백질입니다. 따라서, 피브린 응고 형성을 특성화하는 것은 혈전증의 연구에 유익하다. 탁도 및 혈전 세포법(TEG)은 모두 혈전 형성을 모니터링하기 위한 시험관 내 실험에서 널리 활용된다. 탁도는 분광계를 통해 피브린 응고 구조를 통해 광 투과를 동적으로 측정하며 종종 연구 실험실에서 사용됩니다. TEG는 혈전 강도를 직접 측정하고 주로 환자의 hemostasis를 평가하기 위해 임상 설정에서 활용되는 전문 점탄성 기술입니다. 이 두 가지 도구의 도움으로, 이 연구는 단순화 된 피브리노겐 / 트롬빈 응고 모델을 사용하여 체외 피브린 응고를 특성화하는 방법을 설명합니다. 두 기술의 데이터 추세는 다양한 응고 조건에서 비교되었습니다. 인간과 소 피브린 혈전은 소 응고 요인이 종종 임상 및 연구 설정에 있는 인간 응고 요인에 대용품으로 이용되기 때문에 이 연구에서 나란히 형성되었습니다. 결과는 TEG와 탁도트랙 응고형성이 두 가지 방법을 통해, 함께 활용될 때 다양한 응고 조건에 걸쳐 보완적인 응고 강도와 섬유 구조 정보를 제공한다는 것을 보여줍니다.
Introduction
혈전증은 전 세계적으로 높은 이환율과 사망률로 이어지는 혈액 순환을 차단하는 신체의 혈전의 병리학적 형성입니다. 정맥 혈전 색전증의 1-2 케이스 및 1000명 당 혈전증 유도 혈관 질환의 2 ~3 의 경우 매년1,,2가있습니다. 여기에 제시된 혈전 성형술(TEG) 및 탁도를 활용하여 다양한 응고 조건하에서 응고 형성을 모니터링하는 방법이 있다. 피브린 (ogen)은 신체의 혈전 형성을 담당하는 1 차 단백질입니다. 응고 폭포의 마지막 단계에서, 혈전이 진행됨에 따라 불용성 피브린 단량제의 중합화를 시화하는 혈전에 의해 피브리노펩티드는 피브리노겐으로부터 갈라지며3,,4. 병리학 적 혈전증의 혈전 형성을 이해하려면 다양한 응고 상황에서 피브린 형성을 특성화해야합니다. 여러 응고 모니터링 실험체는 시험관내에서 피브린 응고 형성을 연구하기 위해 활용되었습니다. 프로트롬빈 시간 (PT/INR) 및 활성화 된 부분 혈소 세포 세포 세포 (aPTT)는 특정 응고 경로의 무결성을 측정하는 두 가지 일반적인 임상 적 소이다. 그러나 시간을 물리적 응고 속성5의표시를 제공하지 않는 유일한 변수로 사용합니다. 전자 현미경 검사는 완전히 형성된 피브린 응고의 미세 구조의 시각화를 허용하지만 응고 형성 공정 자체에 대한 정보를 제공하지않습니다 6. 모든 애세 중, 탁도 에세이 및 TEG는 시간이 지남에 따라 동적으로 응고 특성을 추적 할 수있는 기능을 제공합니다. 이러한 기술은 포괄적인 응고 프로파일을 측정할 수 있으므로 다른 피브린 응고 특성화 도구에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다.
특히, 탁도 분석(또는 응고 석탁법)은 단순한 구현과 연구 실험실에서 분광기의 광범위한 접근성으로 인해 연구 및 임상 응용에 널리 사용됩니다. 이 분석법은 정의된 파장에서 개별 반복 판독값을 취하여 성형 응고를 통해 광 투과감을 역동적으로 측정할 수 있게 한다(가장 일반적으로 350 ~700nm 범위의 파장에서)7. 판독 챔버의 온도도 조절될 수 있다. 피브린 젤이 형성됨에 따라 단백질 네트워크를 통과하는 빛의 양이 감소되어 시간이 지남에 따라 흡수도가 증가합니다. 마찬가지로 응고 네트워크가 저하되면 흡광도가 줄어듭니다. 탁도 검사는 멀티플럭스화할 수 있으며 멀티플렉션을 사용하여 멀티플렉션하여 96-384웰 플레이트 모두에서 높은 처리량 샘플 스크리닝을 할 수 있습니다. 여러 응고 특성은 최대 탁도, 최대 탁도시간, 응고 개시 시간 및 응고 형성 속도(Vmax)를 포함하는 탁도 추적 곡선(시간 측정에 따른 흡광도)에서 파생될 수 있습니다. 피브린 섬유 질량/길이 비율은 또한 피브린 섬유 두께8,,9,,10을추정하기 위해 원시 탁도 데이터로부터 도출될 수 있다.
TEG는 주로 환자의 혈전 및 혈전 용해를 평가하기 위해 임상 환경에서 활용됩니다. 또한 일반적으로 항 섬유성 용해성 약물 또는 혈전성 혈액 제품이11,,12를투여해야 하는지 결정하기 위해 외과 응용 분야에서 일반적으로 사용된다. 혈전 형성은 분석이 시작되기 전에 컵에 추가되는 모든 응고 성분과 TEG 컵 내부에서 발생합니다. 진화하는 응고를 가진 컵은 중앙에 삽입되는 핀을 물리적으로 회전시키고 전기 기계 적 비틀림 센서는 응고의 증가점탄성 강도를 측정합니다. 이 분석은 전형적으로 37°C의 생리학적 온도에서 수행됩니다. 그러나 기기에서 온도를 수동으로 조정할 수 있습니다. 최대 진폭(MA), 반응 속도(R), 운동 시간(K), α-angle(Angle), 및 최대 진폭(TMA)까지의 시간은 동적 TEG 추적으로부터 TEG 소프트웨어에 의해 추출된다. 이 값은 전형적으로 환자의 응고 상태를 평가하기 위하여 임상 정상 범위와 비교됩니다. TEG는 정확하게 비스코머는 아니지만 밀리미터 단위로 응고 강도를 측정하기 때문에 의사가 특정 혈액 제품을 투여하고 치료 투여13을조정하기로 결정하는 귀중한 임상 의사 결정 도구로 중요한 점탄성 응고 데이터 및 기능을 제공합니다. TEG와 탁도 분석이 모두 함께 활용될 때, 응고 강도와 운동학이 TEG에서 쉽게 추출되고 피브린 섬유 두께가 광학 탁도 측정에 의해 접근할 수 있기 때문에 보완형 응고 특성화 정보를 제공합니다.
피브린은 혈전의 중요한 구성 요소이기 때문에 다양한 응고 형성 조건 하에서 피브린 응고 특성화는 특정 변수가 혈전 형성 과정 및 궁극적 인 응고 특성에 기여하는 방법에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이를 이해하면 혈전증 진단 및 치료 개발을 위한 지침을 제공할 수 있습니다. 보다 대표적인 피브린 응고 특성화를 얻기 위해 플라즈마는 단순화된 피브리노겐/트롬빈 모델 시스템보다 생체 내 응고 조건과 유사하므로 혈전 형성을 모니터링하기 위해 대체될 수 있다. 그러나 응고 폭포의 복잡한 특성으로 인해 플라즈마를 사용하는 응고 형성이 복잡성을 추가하여 개별 요인의 영향을 격리하기가 더 어려워집니다. 단순화 된 피브리노겐 / 트롬빈 모델을 사용하면 최종 피브린 형성 단계를 격리 할 수있는 전체 응고 캐스케이드를 시작할 필요가 없습니다. 2개의 중요한 피브린 형성 성분 (fibrinogen 및 혈전증)을 포함시킴으로써, 이 설치는 고도로 통제된 응고 형성 조건을 만듭니다. 또한 단순화된 응고 모델을 여기에서 사용하는 동안 이 프로토콜을 활용하여 추가 응고 계자를 포함시켜 보다 복잡한 혈전을 특성화할 수도 있습니다. 본 연구에서는, 피브린 응고 특성화는 다양한 피브리노겐 및 트롬빈 농도, 이온 강도, pH 및 응고 용액에서 의 총 단백질 농도에 의해 수행되어 생체 내 응고 상황에서 다른모방한다(14). 프로토콜에 대한 이러한 변형에 대한 세부 사항은 섹션 5에 포함되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 시판되는 부품을 사용하여 간소화된 피브리노겐/트롬빈 응고 모델을 테스트하는 두 개의 서로 다른 응고 특성화 도구의 활용을 보여줍니다. TEG와 탁도 세약 모두 수행하기 쉽습니다. 최대 응고 형성(TurbMax 및 TEGMax)및 응고 형성 시간(TurbTime 및 TEGTime)과같은 엔드 포인트 응고 검사를 제공할 뿐만 아니라 동적 응고 형성 공정을 평가합니다. 이로 인해 T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
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