Aprovechar la turbidez y la tromboelastografía para la caracterización complementaria del coágulo
Summary
La fibrina es responsable de la formación de coágulos durante la hemostasia y la trombosis. Los ensayos de turbidez y tromboelastograhy (TEG) se pueden utilizar como herramientas sinérgicas que proporcionan una evaluación complementaria de un coágulo. Estas dos técnicas juntas pueden dar más información sobre cómo las condiciones de coagulación afectan la formación de coágulos fibrina.
Abstract
La trombosis es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. La fibrina (génica) es la proteína principal responsable de la formación de coágulos o trombosis. Por lo tanto, caracterizar la formación de coágulos de fibrina es beneficioso para el estudio de la trombosis. La turbidez y la tromboelastografía (TEG) son ensayos in vitro ampliamente utilizados para monitorear la formación de coágulos. La turbidez mide dinámicamente la transmitancia de luz a través de una estructura de coágulo de fibrina a través de un espectrómetro y se utiliza a menudo en laboratorios de investigación. TEG es una técnica viscoelástica especializada que mide directamente la fuerza del coágulo sanguíneo y se utiliza principalmente en entornos clínicos para evaluar la hemostasia de los pacientes. Con la ayuda de estas dos herramientas, este estudio describe un método para caracterizar un coágulo de fibrina in vitro utilizando un modelo simplificado de coágulo de fibrinógeno/trombina. Las tendencias de datos en ambas técnicas se compararon en diversas condiciones de coagulación. Los coágulos de fibrina humana y bovina se formaron uno al lado del otro en este estudio, ya que los factores de coagulación bovina se utilizan a menudo como sustitutos de los factores de coagulación humanos en entornos clínicos y de investigación. Los resultados demuestran que el TEG y la formación de coágulos de la pista de turbidez a través de dos métodos distintos y cuando se utilizan juntos proporcionan resistencia complementaria al coágulo e información estructural de fibra a través de diversas condiciones de coagulación.
Introduction
La trombosis es la formación patológica de un coágulo de sangre en el cuerpo que bloquea la circulación sanguínea que conduce a una alta morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Hay de 1 a 2 casos de tromboembolismo venoso y de 2 a 3 casos de enfermedades vasculares inducidas por trombosis por cada 1000 personas anualmente1,2. Aquí se presenta un método que aprovecha la tromboelastografía (TEG) y la turbidez para controlar la formación de coágulos bajo diversas condiciones de coagulación. La fibrina (ogen) es la proteína primaria que es responsable de la formación de coágulos en el cuerpo. En los últimos pasos de la cascada de coagulación, los fibrinopéptidos se cortan del fibrinógeno por trombina iniciando la polimerización de monómeros de fibrina insolubles a medida que el coágulo se desarrolla3,4. Para entender la formación de coágulos en trombosis patológica, es necesario caracterizar la formación de fibrina bajo diversas circunstancias de coagulación. Múltiples ensayos de monitorización de coágulos se han utilizado para estudiar la formación de coágulos de fibrina in vitro. El tiempo de protrombina (PT/INR) y el tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) son dos ensayos clínicos comunes que miden la integridad de una vía de coagulación específica. Sin embargo, utilizan el tiempo como la única variable que no da ninguna indicación de las propiedades del coágulo físico5. La microscopía electrónica permite la visualización de la microe estructura de un coágulo de fibrina completamente formado, pero no proporciona información sobre el proceso de formación de coágulos en sí6. Entre todos los ensayos, los ensayos de turbidez y TEG ofrecen la capacidad de rastrear las características del coágulo dinámicamente a lo largo del tiempo. Estas técnicas permiten la medición de perfiles de coagulación integrales y, por lo tanto, proporcionan algún beneficio sobre otras herramientas de caracterización de coágulos de fibrina.
Específicamente, los ensayos de turbidez (o turbidimetría de coágulos) se utilizan ampliamente para la investigación y aplicaciones clínicas debido a su implementación simplista y la amplia accesibilidad de los espectrómetros en los laboratorios de investigación. Este ensayo permite una medición dinámica de la transmitancia de luz a través de un coágulo formando tomando lecturas repetitivas individuales a una longitud de onda definida (más comúnmente en una longitud de onda en el rango de 350 – 700 nm)7. La temperatura en la cámara de lectura también se puede ajustar. A medida que se forma el gel de fibrina, la cantidad de luz que viaja a través de la red de proteínas se reduce causando un aumento en la absorbancia con el tiempo. Del mismo modo, la absorbancia disminuye cuando la red de coágulos se degrada. Los ensayos de turbidez se pueden multiplexar fácilmente utilizando un formato de placa de varios pozos para permitir el cribado de muestras de alto rendimiento en placas de 96 y 384 pozos. Varias características del coágulo se pueden derivar de una curva de trazado de turbidez (medición de absorción en el tiempo) que incluyen: turbidez máxima, tiempo hasta la máxima turbidez, tiempo de inicio de la coagulación y tasa de formación de coágulos (Vmax). Una relación masa/longitud de fibra de fibrina también se puede derivar de datos de turbidez en bruto para estimar el espesor de la fibra de fibrina8,9,10.
EL TEG se utiliza principalmente en el entorno clínico para evaluar la hemostasia de los pacientes y la lelisis del coágulo. También se utiliza comúnmente en aplicaciones quirúrgicas para determinar cuándo se deben administrar medicamentos antifibrinolíticos o hemolíticos11,12. La formación de coágulos se produce dentro de una copa TEG con todos los componentes de coagulación que se añaden a la copa antes del inicio del ensayo. La copa, con coágulo en evolución, gira físicamente contra un alfiler que se inserta en su centro y un sensor de torsión electromecánica mide la creciente fuerza viscoelástica del coágulo. Este ensayo se lleva a cabo típicamente a la temperatura fisiológica de 37 oC; sin embargo, la temperatura se puede ajustar manualmente en el instrumento. La amplitud máxima (MA), la velocidad de reacción (R), el tiempo cinético (K), el ángulo de la interfaz (ángulo) y el tiempo hasta la amplitud máxima (TMA) son extraídos por el software TEG del trazado TEG dinámico. Estos valores se comparan típicamente con los rangos clínicos normales para evaluar el estado de coagulación de un paciente. Aunque TEG no es precisamente un viscosímetro, ya que mide la fuerza del coágulo en unidades milimétricas, proporciona importantes datos de coágulos viscoelásticos y funciona como una valiosa herramienta de toma de decisiones clínicas para que los médicos decidan administrar productos sanguíneos específicos y ajustar la dosificación terapéutica13. Cuando los ensayos de TEG y turbidez se utilizan juntos, proporcionan información complementaria de caracterización de coágulos, ya que la fuerza del coágulo y la cinética se extraen fácilmente de TEG y se puede acceder al grosor de la fibra de fibrina mediante mediciones de turbidez óptica.
Como la fibrina es un componente crítico de un coágulo de sangre, la caracterización de coágulos de fibrina bajo diversas condiciones de formación de coágulos puede proporcionar información valiosa sobre cómo una variable específica contribuye al proceso de formación de coágulos y a las propiedades definitivas del coágulo. Comprender esto puede proporcionar orientación para el diagnóstico de trombosis y el desarrollo de terapias. Para obtener una caracterización más representativa de los coágulos de fibrina, el plasma se puede sustituir para supervisar la formación de coágulos, ya que se asemeja más a las condiciones de coagulación in vivo que un sistema de modelo simplificado de fibrinógeno/trombina. Sin embargo, debido a la naturaleza intrincada de la cascada de coagulación, la formación de coágulos utilizando plasma aumenta la complejidad, lo que hace más difícil aislar el impacto de factores individuales. El uso de un modelo simplificado de fibrinógeno/trombina evita la necesidad de iniciar toda la cascada de coagulación permitiendo el aislamiento del paso final de formación de la fibrina. Al incluir dos componentes principales de formación de fibrina (fibrinógeno y trombina), esta configuración crea una condición de formación de coágulos altamente controlada. También es importante tener en cuenta que mientras que el modelo de coágulo simplificado se utiliza aquí, este protocolo también se puede utilizar para caracterizar coágulos más complejos mediante la inclusión de factores de coagulación adicionales. En este estudio, la caracterización de coágulos de fibrina utilizando turbidez y TEG se llevan a cabo variando las concentraciones de fibrinógeno y trombina, fuerza iónica, pH y concentración total de proteínas en la solución de coagulación para imitar diferentes circunstancias de coagulación en vivo14. Los detalles relativos a estas variaciones del protocolo se han incluido en la Sección 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo demuestra la utilización de dos herramientas de caracterización de coágulos distintas que prueban un modelo simplificado de coágulos fibrinógenos/trombina utilizando componentes disponibles comercialmente. Tanto los ensayos de TEG como los de turbidez son fáciles de llevar a cabo. No sólo proporcionan exámenes de coágulos de punto final como la formación máxima de coágulos (TurbMax y TEGMax)y los tiempos de formación de coágulos(Tiempo de turba yTiempo</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
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