Tamamlayıcı Pıhtı Karakterizasyonu için Bulanıklık ve Tromboelastografiden Yararlanma
Summary
Fibrin hemostaz ve tromboz sırasında pıhtı oluşumundan sorumludur. Bulanıklık tahlilleri ve tromboelastograhy (TEG) bir pıhtı tamamlayıcı değerlendirme sağlayan sinerjik araçlar olarak kullanılabilir. Bu iki teknik birlikte pıhtılaşma koşulları fibrin pıhtı oluşumunu nasıl etkilediği hakkında daha fazla fikir verebilir.
Abstract
Tromboz dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Fibrin(ojen) öncelikle pıhtı oluşumu veya tromboz sorumlu proteindir. Bu nedenle fibrin pıhtı oluşumunu karakterize etmek tromboz çalışmasında faydalıdır. Bulanıklık ve tromboelastografi (TEG) pıhtı oluşumunu izlemek için in vitro tahlillerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bulanıklık, ışık iletimini bir spektrometre ile fibrin pıhtı yapısı üzerinden dinamik olarak ölçer ve genellikle araştırma laboratuvarlarında kullanılır. TEG, kan pıhtısı mukavemetini doğrudan ölçen ve öncelikle hastaların hemostazlarını değerlendirmek için klinik ortamlarda kullanılan özel bir viskoelastik tekniktir. Bu iki alet yardımıyla, bu çalışmada basitleştirilmiş fibrinojen/trombin pıhtısı modeli kullanılarak in vitro fibrin pıhtısını karakterize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Her iki teknik genelinde veri eğilimleri çeşitli pıhtılaşma koşulları altında karşılaştırıldı. Bu çalışmada, büyükbaş hayvan pıhtılaşma faktörleri genellikle klinik ve araştırma ortamlarında insan pıhtılaşma faktörlerinin yerine kullanıldığından, insan ve büyükbaş fibrin pıhtıları yan yana oluşmuştur. Sonuçlar, TEG ve bulanıklığın pıhtı oluşumunu iki farklı yöntemle izlediğini ve birlikte kullanıldıklarında farklı pıhtılaşma koşullarında tamamlayıcı pıhtı mukavemeti ve fiber yapısal bilgi sağladığını göstermektedir.
Introduction
Tromboz, vücutta kan dolaşımını engelleyen ve dünya çapında yüksek morbidite ve mortaliteye yol açan bir kan pıhtısının patolojik oluşumudur. Her yıl 1000 kişi başına 1-2 venöz tromboemboli olgusu ve 2-3 tromboza bağlı vasküler hastalıklar olgusu vardır1,2. Burada çeşitli pıhtılaşma koşullarında pıhtı oluşumunu izlemek için tromboelastografi (TEG) ve bulanıklığı kullanma yöntemi sunulmuştur. Fibrin(ojen) vücutta pıhtı oluşumundan sorumlu birincil proteindir. Pıhtılaşma kaskad son adımlarında, fibrinopeptidler pıhtı geliştikçe çözünmez fibrin monomerlerin polimerizasyon unu başlatan trombin tarafından fibrinojen den ayrılır3,4. Patolojik trombozda pıhtı oluşumunu anlamak için çeşitli pıhtılaşma koşullarında fibrin oluşumunu karakterize etmek gerekir. İn vitro fibrin pıhtı oluşumunu incelemek için çoklu pıhtı izleme tsays kullanılmıştır. Protrombin zamanı (PT/INR) ve aktive parsiyel tromboplastin zamanı (aPTT) belirli bir pıhtılaşma yolunun bütünlüğünü ölçen iki ortak klinik tahlildir. Ancak, fiziksel pıhtı özellikleri5hiçbir belirti veren tek değişken olarak zaman kullanın. Elektron mikroskobu tamamen oluşmuş bir fibrin pıhtısının mikro-yapısının görüntülenmesine izin verir ancak pıhtı oluşturma işlemi hakkında bilgi vermez6. Tüm tahliller arasında bulanıklık tahlilleri ve TEG, pıhtı özelliklerini zaman içinde dinamik olarak takip etme olanağı sunar. Bu teknikler kapsamlı pıhtılaşma profillerinin ölçülmesini sağlar ve bu nedenle, diğer fibrin pıhtı karakterizasyon araçları üzerinde bazı yarar sağlar.
Özellikle, bulanıklık tahlilleri (veya pıhtı turbidimetrisi) basit uygulaması ve araştırma laboratuvarlarında spektrometrelerin geniş erişilebilirliği nedeniyle araştırma ve klinik uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu töz, tanımlanmış bir dalga boyunda (en sık 350 – 700 nm aralığında bir dalga boyunda)7tek tek tekrarlayan okumalar alarak bir şekillendirme pıhtısı ile ışık iletimi dinamik bir ölçüm sağlar. Okuma odasındaki sıcaklık da ayarlanabilir. Fibrin jel formları gibi, protein ağı üzerinden seyahat ışık miktarı zaman içinde absorbance bir artışa neden azalır. Benzer şekilde, pıhtı ağı bozulduğunda emme azalır. Bulanıklık tahlilleri, hem 96 hem de 384 plakalı yüksek iş elde numune taraması için çok kuyulu plaka biçimi kullanılarak kolayca çok yönlü olarak katlanabilir. Çeşitli pıhtı özellikleri bir bulanıklık izleme eğrisi (zaman ölçümü içinde absorbe) türetilebilir: maksimum bulanıklık, maksimum bulanıklık için zaman, pıhtı başlangıçlı zaman, ve pıhtı oluşum hızı (Vmax). Bir fibrin lif kütlesi / uzunluk oranı da fibrin lif kalınlığı8,9,,10tahmin ham bulanıklık verileri elde edilebilir.
TEG öncelikle hastaların hemostaz ve pıhtı iliklerini değerlendirmek için klinik ortamda kullanılmaktadır. Ayrıca yaygın anti-fibrinolitik ilaçlar veya hemostatik kan ürünleri,11,12uygulanmalıdır belirlemek için cerrahi uygulamalarda kullanılır. Pıhtı oluşumu, bir TEG bardağının içinde, tözün başlamasından önce tüm pıhtılaşma bileşenlerinin bardağa eklenmesiyle oluşur. Gelişen pıhtıya sahip bardak, fiziksel olarak merkezine yerleştirilen bir iğneye karşı döner ve elektromekanik burulma sensörü pıhtının artan viskoelastik gücünü ölçer. Bu test genellikle 37 °C fizyolojik sıcaklıkta yapılır; ancak, sıcaklık cihaz üzerinde manuel olarak ayarlanabilir. Maksimum genlik (MA), reaksiyon hızı (R), kinetik zaman (K), α-açı (Açı) ve maksimum genlik (TMA) için zaman dinamik TEG izleme DEN TEG yazılımı tarafından ayıklanır. Bu değerler genellikle hastanın pıhtılaşma durumunu değerlendirmek için klinik normal aralıklarla karşılaştırılır. TEG tam olarak bir viskometre birimi olmamakla birlikte, milimetre ünitelerinde pıhtı mukavemetini ölçtürünce, hekimlerin spesifik kan ürünlerini yönetmeye karar vermeleri ve terapötik dozlamayı ayarlamaları için değerli bir klinik karar verme aracı olarak önemli viskoelastik pıhtı verileri ve işlevleri ni sağlar13. Hem TEG hem de bulanıklık tahlilleri birlikte kullanıldıklarında, pıhtı mukavemeti ve kinetikte TEG’den kolayca çıkarılabildiği ve fibrin lif kalınlığına optik bulanıklık ölçümleri ile ulaşılabildiği için tamamlayıcı pıhtı karakterizasyonu bilgileri sağlarlar.
Fibrin bir kan pıhtısı kritik bir bileşeni olduğu gibi, farklı pıhtı oluşumu koşulları altında fibrin pıhtı karakterizasyonu belirli bir değişken pıhtı oluşum süreci ve nihai pıhtı özellikleri katkıda nasıl değerli bir fikir sağlayabilir. Bunu anlamak tromboz tanısı ve terapötik gelişimi için rehberlik sağlayabilir. Daha temsili bir fibrin pıhtı karakterizasyonu elde etmek için, plazma basitleştirilmiş fibrinojen/trombin model sisteminden daha yakından in vivo pıhtılaşma koşullarına benzediği için pıhtı oluşumunu izlemek için ikame edilebilir. Ancak, pıhtılaşma kaskad karmaşık doğası nedeniyle, plazma kullanarak pıhtı oluşumu karmaşıklığı ekler, daha zor bireysel faktörlerin etkisini izole etmek için yapım. Basitleştirilmiş bir fibrinojen/trombin modelinin kullanılması, son fibrin oluşum adımının izolasyona izin vererek pıhtılaşma kaskadlarının tamamının başlatılması ihtiyacını önler. İki ana fibrin oluşturan bileşenleri (fibrinojen ve trombin) dahil ederek, bu kurulum son derece kontrollü bir pıhtı oluşumu durumu oluşturur. Basitleştirilmiş pıhtı modeli burada kullanılırken, bu protokolün ek pıhtılaşma faktörleri de dahil edilerek daha karmaşık pıhtıları karakterize etmek için de kullanılabileceğini belirtmek önemlidir. Bu çalışmada, bulanıklık ve TEG kullanılarak fibrin pıhtı karakterizasyonu fibrinojen ve trombin konsantrasyonları, iyonik mukavemet, pH ve pıhtılaşma çözeltisinde toplam protein konsantrasyonu ile farklı in vivo pıhtılaşma durumlarını taklit etmek için14. Protokoldeki bu varyasyonlarla ilgili ayrıntılar Bölüm 5’te yer almaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, basitleştirilmiş bir fibrinojen/trombin pıhtı modelini ticari olarak kullanılabilen bileşenler kullanılarak test eden iki farklı pıhtı karakterizasyon aracının kullanımını göstermektedir. Hem TEG hem de bulanıklık tahlillerinin yapılması kolaydır. Max pıhtı oluşumu (TurbMax ve TEGMax)ve pıhtı oluşum süreleri (TurbTime ve TEGTime)gibi uç nokta pıhtı muayenelerini sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda dinamik pıhtı şekillendirme süre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiçbiri.
Materials
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural origins of fibrin clot rheology. Biophysical Journal. 77 (5), 2813-2826 (1999).
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. . Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. . The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
