JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

تقدير البلورات النانوية البولية في البشر باستخدام تسمية فلوروفور الكالسيوم وتحليل تتبع الجسيمات النانوية

Published: February 09, 2021
doi:
10.3791/62192
, ,
1Department of Urology,University of Alabama at Birmingham

Summary

كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد ما إذا كان تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) يمكن الكشف عن الكالسيوم البولي الذي يحتوي على بلورات نانوية من البالغين الأصحاء وقياسه كميا. تشير النتائج المستخلصة من الدراسة الحالية إلى أن NTA يمكن أن يكون أداة محتملة لتقدير البلورات النانوية البولية أثناء أمراض حصى الكلى.

Abstract

حصى الكلى أصبحت أكثر انتشارا في جميع أنحاء العالم في البالغين والأطفال. يتكون النوع الأكثر شيوعا من حصى الكلى من بلورات أوكسالات الكالسيوم (CaOx). يحدث البلورة عندما يصبح البول مشبعا بالمعادن (مثل الكالسيوم والأوكسيالات والفوسفات) ويسبق تكوين حصوات الكلى. وتشمل الطرق القياسية لتقييم البلورات في الحجر السابق المجهر والترشيح والطرد المركزي. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تكشف في المقام الأول البلورات الدقيقة وليس البلورات النانوية. وقد اقترح البلورات النانوية لتكون أكثر ضررا على الخلايا الظهارية الكلى من البلورات الدقيقة في المختبر. هنا، نقوم بوصف قدرة تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) على اكتشاف البلورات النانوية البولية البشرية. تم تغذية البالغين الأصحاء بنظام غذائي أوكسالات خاضع للرقابة قبل شرب حمولة أوكسالات لتحفيز البلورات النانوية البولية. تم جمع البول لمدة 24 ساعة قبل وبعد الحمل oxalate. وجرى تجهيز العينات وغسلها بالإيثانول لتنقية العينات. كانت البلورات النانوية البولية ملطخة بالفلوروفور الملزم للكالسيوم ، Fluo-4 AM. بعد التلطيخ ، تم تحديد حجم وعدد البلورات النانوية باستخدام NTA. تظهر النتائج المستخلصة من هذه الدراسة أن NTA يمكنها الكشف بكفاءة عن البلورات النانوية لدى البالغين الأصحاء. تشير هذه النتائج إلى أن NTA يمكن أن يكون طريقة اكتشاف مبكر قيمة للبلورات النانوية في المرضى الذين يعانون من مرض حصى الكلى.

Introduction

تتشكل بلورات البول عندما يصبح البول مشبعا بالمعادن. هذا يمكن أن يحدث في الأفراد الأصحاء ولكن هو أكثر شيوعا في الأفراد الذين يعانون من حصى الكلى1. وجود وتراكم بلورات البولية يمكن أن تزيد من خطر واحد لتطوير حصى الكلى. على وجه التحديد، يحدث هذا عندما بلورات ربط لوحة راندال، نواة، تتراكم، وتنمو مع مرور الوقت2،3،4. Crystalluria يسبق تشكيل حصى الكلى وتقييم البلورات قد يكون لها قيمة تنبؤية في الكلى حصى السابقين3,5. على وجه التحديد، وقد اقترح crystalluria لتكون مفيدة للتنبؤ بخطر تكرار الحجر في المرضى الذين يعانون من تاريخ من أوكسالات الكالسيوم التي تحتوي علىالحجارة 6،7.

وقد تم الإبلاغ عن بلورات تؤثر سلبا على الظهارية الكلوية وتعميم وظيفة الخلايا المناعية8,9,10,11,12,13. وقد أفيد سابقا أن تعميم monocytes من أوكسالات الكالسيوم (CaOx) حصى الكلى السابقين قد قمعت الجيستيك الحيوي الخلوية بالمقارنة مع الأفراد الأصحاء14. وبالإضافة إلى ذلك، بلورات CaOx تقليل الجيستيك الحيوي الخلوية وتعطيل التوازن الأكسدة في monocytes8. استهلاك وجبات الطعام الغنية في أوكسالات قد يسبب البلورات التي يمكن أن تؤدي إلى تلف أنبوبي كلوي وتغيير إنتاج ووظيفة الجزيئات الكلية البولية التي هي واقية ضد تشكيل حصى الكلى15,16. وقد أثبتت العديد من الدراسات أن بلورات البولية يمكن أن تختلف في الشكل والحجم اعتمادا على درجة الحموضة ودرجة حرارة البول17،18،19. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت البروتينات البولية لتعديل السلوك الكريستال20. واقترحت Daudon وآخرون19, أن تحليل البلورات يمكن أن تكون مفيدة في إدارة المرضى الذين يعانون من أمراض حصى الكلى وفي تقييم استجابتهم للعلاجات. وهناك عدد قليل من الطرق التقليدية المتاحة حاليا لتقييم وجود بلورات تشمل المستقطبة المجهر21،22، المجهر الإلكتروني23، عدادات الجسيمات3، ترشيح البول24، التبخر3،5 أو الطرد المركزي21. وقد وفرت هذه الدراسات رؤية قيمة لحقل حصى الكلى فيما يتعلق بالكريستال. ومع ذلك، كان أحد القيود المفروضة على هذه الأساليب هو عدم القدرة على تصور البلورات التي يقل حجمها عن 1 ميكرومتر وقياسها كميا. بلورات من هذا الحجم قد تؤثر على نمو الحجارة CaOx عن طريق إرفاق لوحة راندال.

وقد ثبت أن البلورات النانوية تسبب إصابات واسعة النطاق للخلايا الكلوية مقارنة مع البلورات الدقيقة الأكبر25. وقد تم الإبلاغ عن وجود البلورات النانوية في البول باستخدام محلل الجسيمات النانوية26،27. وقد استخدمت الدراسات الحديثة مسابير الفوسفات المسمى الفلوري (اليندرونات-فلوريسين/اليندرونات-Cy5) لفحص البلورات النانوية باستخدام قياس الخلايا التدفق النانوي28. الحد من هذه الصبغة هو أنه ليس محددا وسوف يرتبط تقريبا جميع أنواع الحجارة باستثناء السيستين. وبالتالي، فإن التقييم الدقيق لوجود البلورات النانوية لدى الأفراد قد يكون أداة فعالة لتشخيص البلورات و/أو التنبؤ بخطر الحجر. كان الغرض من هذه الدراسة هو الكشف عن الكالسيوم المحتوي على بلورات نانوية (<1 ميكرومتر في الحجم) وتحديده كميا باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). ولتحقيق ذلك، تم استخدام تقنية NTA بالاشتراك مع فلوفور ملزم للكالسيوم، فلو-4 AM للكشف عن الكالسيوم الذي يحتوي على بلورات نانوية في بول البالغين الأصحاء وتحديد كميا.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب المبينة في هذا العمل من قبل جامعة ألاباما في برمنغهام (UAB) مجلس المراجعة المؤسسية. تم تسجيل البالغين الأصحاء (33.6 ± 3.3 سنة؛ n =10) في الدراسة إذا كان لديهم لوحة التمثيل الغذائي الشاملة الدم العادي، غير متعاطي التبغ، غير الحوامل، مؤشر كتلة الجسم بين 20-30 كجم / م2،</sup…

Representative Results

تظهر النتائج المستخلصة من هذه الدراسة أن NTA يمكنها الكشف بكفاءة عن متوسط حجم وتركيز الكالسيوم الذي يحتوي على بلورات نانوية بولية في بول الإنسان. وقد تحقق ذلك باستخدام الفلوروفور، وفلو-4 صباحا، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية. فلو-4 AM كان قادرا على ربط كل من CaOx وبلورات CAP. وكما هو مبين في <strong clas…

Discussion

وقد استخدمت NTA في هذه الدراسة لتقييم البلورات النانوية في البول البشري باستخدام مسبار ربط الكالسيوم، فلو-4 AM. لا توجد طريقة قياسية متاحة للكشف عن البلورات النانوية في البول. وقد اكتشفت بعض المجموعات البحثية البلورات النانوية في البول واعتمدت على استخدام بروتوكولات واسعة النطاق أو أساليب ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون جميع المشاركين في الدراسة وUAB CCTS التغذية الحيوية الأساسية ومركز خدمة التصوير عالي الدقة UAB لمساهماتهم. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح DK106284 و DK123542 (TM) ، وUL1TR003096 (المركز الوطني للنهوض بالعلوم الترجمية).

Materials

Benchtop Centrifuge Jouan Centrifuge CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate Synthesized in the lab as previously described29. Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) Sigma 677418 Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol Fischer Scientific AC615095000 Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM* AAT Bioquest, Inc. 20550 Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles Sigma 742031 Store at 2-8°C
NanoSight Instrument Malvern Instruments, UK NS300
Syringe pump Harvard Apparatus 98-4730
Virkon Disinfectant LanXESS Energizing Company, Germany LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
  2. Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall’s plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
  3. Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
  4. Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
  5. Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone “activity”. British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
  6. Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
  7. Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
  8. Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
  9. Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
  10. Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
  11. Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
  12. Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
  13. Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
  14. Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
  15. Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
  16. Khan, S. R., Kok, D. J. Modulators of urinary stone formation. Frontiers in Bioscience. 9, 1450-1482 (2004).
  17. Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
  18. Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
  19. Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, 624-632 (2016).
  20. Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
  21. Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
  22. Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. . Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , 261-263 (2001).
  23. Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H. Crystalluria. Journal of Crystal Growth. 53 (1), 166-181 (1981).
  24. Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
  25. Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
  26. He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
  27. Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
  28. Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
  29. Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
  30. Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research–A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
  31. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  32. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
  33. Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
  34. Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
  35. Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
  36. Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
  37. Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
  38. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  39. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
  40. Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson’s disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).

Tags

Keywords: Urinary NanocrystalsCalcium Fluorophore LabelingNanoparticle Tracking AnalysisKidney Stone FormationCrystal UreaOxalate LoadUrine PHUrine VolumeCalcium OxalateCalcium PhosphateFluo-4 AMGold NanoparticlesNanoparticle Tracking Analysis (NTA)
check_url/cn/62192?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kumar, P., Bell, A., Mitchell, T. Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis. J. Vis. Exp. (168), e62192, doi:10.3791/62192 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image