Schatting van urinenanokristallen bij mensen met behulp van calciumfluorofooretikettering en nanodeeltjestrackinganalyse
Summary
Het doel van deze studie was om te bepalen of nanodeeltjestrackinganalyse (NTA) urinecalcium met nanokristallen van gezonde volwassenen kon detecteren en kwantificeren. De bevindingen van de huidige studie suggereren dat NTA een potentieel hulpmiddel kan zijn om urinaire nanokristallen tijdens niersteenziekte te schatten.
Abstract
Nierstenen komen wereldwijd steeds vaker voor bij volwassenen en kinderen. De meest voorkomende soort niersteen bestaat uit calciumoxalaat (CaOx) kristallen. Kristallurie treedt op wanneer urine oververzadigd raakt met mineralen (bijv. calcium, oxalaat, fosfaat) en voorafgaat aan de vorming van niersteen. Standaardmethoden om kristallurie in steenvormers te beoordelen, omvatten microscopie, filtratie en centrifugeren. Deze methoden detecteren echter voornamelijk microkristallen en geen nanokristallen. Nanokristallen zijn in vitro schadelijker voor nierepitheelcellen dan microkristallen. Hier beschrijven we het vermogen van Nanoparticle Tracking analysis (NTA) om menselijke nanokristallen in de urine te detecteren. Gezonde volwassenen kregen een gecontroleerd oxalaatdieet voordat ze een oxalaatbelasting dronken om nanokristallen in de urine te stimuleren. Urine werd 24 uur voor en na de oxalaatbelasting verzameld. Monsters werden verwerkt en gewassen met ethanol om monsters te zuiveren. Urine nanokristallen waren bevlekt met de calciumbindende fluorofoor, Fluo-4 AM. Na het kleuren werden de grootte en het aantal nanokristallen bepaald met behulp van NTA. De bevindingen van deze studie tonen aan dat NTA nanokristallurie efficiënt kan detecteren bij gezonde volwassenen. Deze bevindingen suggereren dat NTA een waardevolle vroege detectiemethode van nanokristallijne bij patiënten met niersteenziekte kan zijn.
Introduction
Urinekristallen vormen zich wanneer urine oververzadigd raakt met mineralen. Dit kan voorkomen bij gezonde personen, maar komt vaker voor bij personen met nierstenen1. De aanwezigheid en accumulatie van urinekristallen kan het risico op het ontwikkelen van een niersteen verhogen. In het bijzonder gebeurt dit wanneer kristallen zich binden aan Randall’s plaque, nucleeren, accumuleren en groeien in de loop van de tijd2,3,4. Crystalluria gaat vooraf aan de vorming van nierstenen en de beoordeling van kristallurie kan voorspellende waarde hebben in niersteenvormers3,5. In het bijzonder is gesuggereerd dat kristallurie nuttig is om het risico op steenrecidief te voorspellen bij patiënten met een voorgeschiedenis van calciumoxalaat dat stenenbevat 6,7.
Er is gemeld dat kristallen een negatieve invloed hebben op de nierepitheel- en circulerende immuuncelfunctie8,9,10,11,12,13. Eerder is gemeld dat circulerende monocyten uit calciumoxalaat (CaOx) niersteen voormalige cellulaire bio-energetica hebben onderdrukt in vergelijking met gezonde individuen14. Bovendien verminderen CaOx-kristallen cellulaire bio-energetica en verstoren ze de redoxhomeostase in monocyten8. Consumptie van maaltijden die rijk zijn aan oxalaat kan kristallurie veroorzaken, wat kan leiden tot schade aan de niertubulus en de productie en functie van macromoleculen in de urine kan veranderen die beschermen tegen niersteenvorming15,16. Verschillende studies hebben aangetoond dat urinekristallen kunnen variëren in vorm en grootte, afhankelijk van de pH en temperatuur van de urine17,18,19. Verder is aangetoond dat urine-eiwitten kristalgedrag moduleren20. Daudon et al.19, stelden voor dat kristalluria-analyse nuttig zou kunnen zijn bij de behandeling van patiënten met niersteenziekte en bij het beoordelen van hun reactie op therapieën. Enkele conventionele methoden die momenteel beschikbaar zijn om de aanwezigheid van kristallen te evalueren , zijn gepolariseerde microscopie21,22, elektronenmicroscopie23, deeltjestellers3, urinefiltratie24, verdamping3,5 of centrifugeren21. Deze studies hebben waardevol inzicht gegeven in het niersteenveld met betrekking tot kristallurie. Een beperking van deze methoden was echter het onvermogen om kristallen van minder dan 1 μm groot te visualiseren en te kwantificeren. Kristallen van deze grootte kunnen de groei van CaOx-stenen beïnvloeden door zich aan Randalls plaquette te hechten.
Nanokristallen blijken uitgebreide schade aan niercellen te veroorzaken in vergelijking met grotere microkristallen25. De aanwezigheid van nanokristallen is gemeld in de urine met behulp van een nanodeeltjesanalysator26,27. Recente studies hebben fluorescerend gelabelde bisfosfaatsondes (alendronaat-fluoresceïne/alendronaat-Cy5) gebruikt om nanokristallen te onderzoeken met behulp van nanoschaalstroomcytometrie28. De beperking van deze kleurstof is dat het niet specifiek is en zich zal binden aan bijna alle soorten stenen behalve cysteïne. Het nauwkeurig beoordelen van de aanwezigheid van nanokristallen bij individuen kan dus een effectief hulpmiddel zijn om kristallurie te diagnosticeren en/of steenrisico te voorspellen. Het doel van deze studie was om calcium bevattende nanokristallen (<1 μm groot) te detecteren en te kwantificeren met behulp van nanodeeltjestrackinganalyse (NTA). Om dit te bereiken, werd NTA-technologie gebruikt in combinatie met een calciumbindende fluorofoor, Fluo-4 AM om calcium met nanokristallen in de urine van gezonde volwassenen te detecteren en te kwantificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
NTA is in deze studie gebruikt om nanokristallen in menselijke urine te beoordelen met behulp van een calciumbindende sonde, Fluo-4 AM. Er is geen standaardmethode beschikbaar om nanokristallen in de urine te detecteren. Sommige onderzoeksgroepen hebben nanokristallen in de urine gedetecteerd en vertrouwden op het gebruik van uitgebreide protocollen of methoden die beperkt zijn in hun vermogen om de monsters te kwantificeren27,28. Deze studie toont een specifieke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken alle deelnemers aan de studie en de UAB CCTS Bionutrition Core en UAB High Resolution Imaging Service Center voor hun bijdragen. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies DK106284 en DK123542 (TM) en UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences).
Materials
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. | |||
References
- Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
- Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall’s plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
- Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
- Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
- Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone “activity”. British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
- Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
- Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
- Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
- Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
- Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
- Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
- Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
- Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
- Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
- Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
- Khan, S. R., Kok, D. J. Modulators of urinary stone formation. Frontiers in Bioscience. 9, 1450-1482 (2004).
- Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
- Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
- Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, 624-632 (2016).
- Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
- Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
- Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. . Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , 261-263 (2001).
- Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H. Crystalluria. Journal of Crystal Growth. 53 (1), 166-181 (1981).
- Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
- Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
- He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
- Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
- Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
- Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
- Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research–A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
- Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
- Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
- Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson’s disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).
