JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Kalsiyum Florofor Etiketleme ve Nanopartikül Takip Analizi Kullanılarak İnsanlarda Üriner Nanokristallerin Tahmini

Published: February 09, 2021
doi:
10.3791/62192
, ,
1Department of Urology,University of Alabama at Birmingham

Summary

Bu çalışmanın amacı, nanopartikül izleme analizinin (NTA) sağlıklı yetişkinlerden gelen nanokristal içeren üriner kalsiyumu tespit edip ölçemediğini belirlemekti. Mevcut çalışmadan elde edilen bulgular, NTA’nın böbrek taşı hastalığı sırasında idrar nanokristallerini tahmin etmek için potansiyel bir araç olabileceğini göstermektedir.

Abstract

Böbrek taşları yetişkinlerde ve çocuklarda dünya çapında daha yaygın hale gelmektedir. En yaygın böbrek taşı türü kalsiyum oksalat (CaOx) kristallerinden oluşur. Kristalüri, idrarın minerallerle (örneğin kalsiyum, oksalat, fosfat) doymamış olması ve böbrek taşı oluşumundan önce gelmesiyle ortaya çıkar. Taş eskilerde kristalürisi değerlendirmek için standart yöntemler mikroskopi, filtrasyon ve santrifüjlemedir. Bununla birlikte, bu yöntemler öncelikle nanokristalleri değil mikrokristalleri tespit eder. Nanokristallerin böbrek epitel hücrelerine mikrokristal in vitrodan daha zararlı olduğu ileri sürülmüştür. Burada Nanopartikül Takip analizinin (NTA) insan üriner nanokristallerini tespit etme yeteneğini açıklıyoruz. Sağlıklı yetişkinler, idrar nanokristallerini uyarmak için oksalat yükü içmeden önce kontrollü bir oksalat diyeti ile beslendi. İdrar, oksalat yükünden önce ve sonra 24 saat boyunca toplandı. Numuneler işlendi ve numuneleri arındırmak için etanol ile yıkandı. Üriner nanokristaller kalsiyum bağlayıcı florofor, Fluo-4 ile boyandı. Lekelemeden sonra NTA kullanılarak nanokristallerin büyüklüğü ve sayısı belirlendi. Bu çalışmadan elde edilen bulgular, NTA’nın sağlıklı yetişkinlerde nanokristalüriyi verimli bir şekilde tespit dürebildiğini göstermektedir. Bu bulgular, böbrek taşı hastalığı olan hastalarda NTA’nın nanokristalürinin değerli bir erken teşhis yöntemi olabileceğini göstermektedir.

Introduction

İdrar minerallerle doymamış hale geldiğinde idrar kristalleri oluşur. Bu sağlıklı bireylerde ortaya çıkabilir, ancak böbrek taşı olan bireylerde daha yaygındır1. İdrar kristallerinin varlığı ve birikimi, kişinin böbrek taşı geliştirme riskini artırabilir. Özellikle, kristaller Randall’ın plağında bağlandığında, çekirdeklendiğinde, biriktiğinde ve zamanla büyüdüğünde ortaya çıkar2,3,4. Kristalüri böbrek taşı oluşumundan önce gelir ve kristalürinin değerlendirilmesi böbrek taşı eskilerinde tahmin değerine sahip olabilir3,5. Özellikle, kristalürinin taş içeren kalsiyum oksalat öyküsü olan hastalarda taş tekrarlama riskini tahmin etmek için yararlı olduğu öne sürülmemiştir6,7.

Kristallerin renal epitel ve dolaşımdaki immün hücre fonksiyonu8, 9,10,11,12,13’üolumsuz etkilediği bildirilmiştir. Kalsiyum oksalat (CaOx) böbrek taşı eskilerinden dolaşımdaki monositlerin sağlıklı bireylere kıyasla hücresel biyoenergetikleri baskılatıldığı daha önce bildirilmiştir14. Ek olarak, CaOx kristalleri hücresel biyoenergetikleri azaltır ve monositlerde redoks homeostazını bozar8. Oksalat bakımından zengin öğünlerin tüketimi, böbrek tübül hasarına yol açabilecek ve böbrek taşı oluşumuna karşı koruyucu olan üriner makromoleküllerin üretimini ve işlevini değiştirebilecek kristalüre neden olabilir15,16. Çeşitli çalışmalar idrar kristallerinin idrarın pH’ına ve sıcaklığına bağlı olarak şekil ve boyut olarak değişebileceğini göstermiştir17,18,19. Ayrıca, üriner proteinlerin kristal davranışını modüle etmesi gösterilmiştir20. Daudon ve ark.19, kristalüri analizinin böbrek taşı hastalığı olan hastaların yönetiminde ve tedavilere yanıtlarını değerlendirmede yardımcı olabileceğini önerdi. Kristallerin varlığını değerlendirmek için şu anda mevcut olan birkaç geleneksel yöntem polarize mikroskopi21,22,elektron mikroskopisi23, parçacık sayaçları3, idrar filtrasyonu 24 , buharlaşma3,5 veya santrifüjleme21‘dir. Bu çalışmalar kristalürür ile ilgili böbrek taşı alanına değerli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin bir sınırlaması, 1 μm’den küçük kristallerin görselleştirilememiş ve ölçülememesi olmuştur. Bu büyüklükteki kristaller Randall’ın plaketine bağlanarak CaOx taşlarının büyümesini etkileyebilir.

Nanokristallerin daha büyük mikrokristallere kıyasla renal hücrelerde geniş çaplı yaralanmaya neden olduğu gösterilmiştir25. Nanokristallerin varlığı bir nanopartikül analizörü kullanılarak idrarda bildirilmiştir26,27. Son çalışmalar nano ölçekli akış sitometrisi kullanarak nanokristalleri incelemek için floresan etiketli bifosfat probları (alendronat-floresan/ alendronat-Cy5)kullanmıştır. Bu boyanın sınırlaması, spesifik olmaması ve sistein hariç hemen hemen her tür taşa bağlanacak olmasıdır. Bu nedenle, bireylerde nanokristallerin varlığını doğru bir şekilde değerlendirmek, kristalürür teşhisi koymak ve / veya taş riskini tahmin etmek için etkili bir araç olabilir. Bu çalışmanın amacı nanokristal izleme analizi (NTA) kullanarak nanokristal içeren kalsiyumun (<1 μm boyutunda) tespit ve ölçülmesiydi. Bunu başarmak için, NTA teknolojisi, sağlıklı yetişkinlerin idrarında nanokristal içeren kalsiyumu tespit etmek ve ölçmek için fluo-4 AM kalsiyum bağlayıcı bir florofor ile birlikte kullanılmıştır.

Protocol

Bu çalışmada özetlenen tüm deneyler Birmingham’daki Alabama Üniversitesi (UAB) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Sağlıklı yetişkinler (33,6 ± 3,3 yaşında; n=10) normal kan kapsamlı metabolik paneli, tütün dışı kullanıcıları, hamile olmayanları, 20-30 kg/m2arasında bir VKİ’leri varsa ve kronik tıbbi rahatsızlıkları veya akut hastalıkları yoksa çalışmaya alındı. Sağlıklı katılımcılar, çalışmaya başlamadan önce yazılı bir bilgilendirilmiş ona…

Representative Results

Bu çalışmadan elde edilen bulgular, NTA’nın insan idrarında idrar nanokristalleri içeren kalsiyumun ortalama boyutunu ve konsantrasyonu olduğunu verimli bir şekilde tespit edebildiği göstermektedir. Bu, florofor, Fluo-4 ve nanopartikül izleme analizi kullanılarak elde edildi. Fluo-4 hem CaOx hem de CaP kristallerine bağlanabildi. Şekil 3A’dagösterildiği gibi, CaOx kristallerinin 50-270 nm arasında olduğu ve ortalama 1.26 x 109 parçacık/ mL konsantrasyona sahip …

Discussion

NTA, bu çalışmada insan idrarındaki nanokristalleri kalsiyum bağlayıcı bir prob olan Fluo-4 AM kullanarak değerlendirmek için kullanılmıştır. İdrardaki nanokristalleri tespit etmek için standart bir yöntem yoktur. Bazı araştırma grupları idrarda nanokristaller tespit etmiş ve örnekleri ölçme yetenekleri sınırlı olan kapsamlı protokollerin veya yöntemlerin kullanılmasına güvenmektedir27,28. Bu çalışma, yüksek oksalat yükünden …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar tüm çalışma katılımcılarına ve UAB CCTS Bionutrition Core ve UAB Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Servis Merkezi’ne katkılarından dolayı teşekkür eder. Bu çalışma NIH tarafından DK106284 ve DK123542 (TM) ve UL1TR003096 (Ulusal Çeviri Bilimleri İlerleyen Merkez) hibeleri ile desteklendi.

Materials

Benchtop Centrifuge Jouan Centrifuge CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate Synthesized in the lab as previously described29. Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) Sigma 677418 Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol Fischer Scientific AC615095000 Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM* AAT Bioquest, Inc. 20550 Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles Sigma 742031 Store at 2-8°C
NanoSight Instrument Malvern Instruments, UK NS300
Syringe pump Harvard Apparatus 98-4730
Virkon Disinfectant LanXESS Energizing Company, Germany LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
  2. Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall’s plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
  3. Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
  4. Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
  5. Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone “activity”. British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
  6. Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
  7. Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
  8. Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
  9. Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
  10. Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
  11. Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
  12. Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
  13. Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
  14. Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
  15. Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
  16. Khan, S. R., Kok, D. J. Modulators of urinary stone formation. Frontiers in Bioscience. 9, 1450-1482 (2004).
  17. Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
  18. Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
  19. Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, 624-632 (2016).
  20. Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
  21. Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
  22. Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. . Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , 261-263 (2001).
  23. Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H. Crystalluria. Journal of Crystal Growth. 53 (1), 166-181 (1981).
  24. Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
  25. Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
  26. He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
  27. Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
  28. Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
  29. Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
  30. Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research–A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
  31. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  32. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
  33. Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
  34. Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
  35. Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
  36. Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
  37. Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
  38. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  39. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
  40. Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson’s disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).

Tags

Keywords: Urinary NanocrystalsCalcium Fluorophore LabelingNanoparticle Tracking AnalysisKidney Stone FormationCrystal UreaOxalate LoadUrine PHUrine VolumeCalcium OxalateCalcium PhosphateFluo-4 AMGold NanoparticlesNanoparticle Tracking Analysis (NTA)
check_url/cn/62192?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kumar, P., Bell, A., Mitchell, T. Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis. J. Vis. Exp. (168), e62192, doi:10.3791/62192 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image