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医学

カルシウム蛍光色素標識とナノ粒子追跡解析を用いたヒトの尿中ナノ結晶の推定

Published: February 09, 2021
doi:
10.3791/62192
, ,
1Department of Urology,University of Alabama at Birmingham

Summary

本研究の目的は、ナノ粒子追跡解析(NTA)が健康な成人からのナノ結晶を含む尿中カルシウムを検出し、定量化できるかどうかを決定することであった。現在の研究結果は、NTAが腎臓結石疾患中の尿ナノ結晶を推定する潜在的なツールである可能性を示唆している。

Abstract

腎臓結石は、大人と子供の世界的に一般的になってきています。最も一般的なタイプの腎臓結石は、シュウ酸カルシウム(CaOx)結晶で構成されています。結晶尿は、尿がミネラル(例えば、カルシウム、シュウ酸塩、リン酸塩)で過飽和になると発生し、腎臓結石形成の前に起こる。石のフォーマーの結晶を評価する標準的な方法には、顕微鏡、ろ過、遠心分離が含まれます。しかし、これらの方法は、主にナノ結晶ではなく微小結晶を検出する。ナノ結晶は、インビトロの微結晶よりも腎臓上皮細胞に有害であることが示唆されている。ここでは、ナノ粒子追跡解析(NTA)がヒトの尿中ナノ結晶を検出する能力について述べる。健康な成人は、尿中ナノ結晶を刺激するためにシュウ酸塩負荷を飲む前に、制御されたシュウ酸食を与えられた。尿はシュウ酸負荷の前後に24時間採取した。試料を処理し、エタノールで洗浄し、試料を精製した。尿中ナノ結晶をカルシウム結合蛍光色素で染色し、フルオ-4 AM.染色後、ナノ結晶のサイズと数はNTAを用いて決定した。この研究結果から、NTAは健康な成人のナノ結晶を効率的に検出できることを示している。これらの知見は、NTAが腎臓結石症患者におけるナノ結晶の貴重な早期発見方法である可能性を示唆している。

Introduction

尿結晶は、尿がミネラルで過飽和になると形成されます。これは健康な個体で起こり得るが、腎臓結石1を有する個人でより一般的である。尿結晶の存在と蓄積は、腎臓結石を発症するリスクを高めることができます。具体的には、これは、結晶がランドールのプラークに結合し、核を持ち、蓄積し、時間2、3、4の間に成長するときに起こる。結晶は、腎臓結石の形成と結晶の評価に先行して、腎臓結石形成体3,5に予測値を有する可能性がある。具体的には、結晶が石6,7を含むシュウ酸カルシウムの既往歴を有する患者において石の再発のリスクを予測するのに有用であることが示唆されている。

結晶は、腎上皮および循環免疫細胞機能8、9、10、11、12、13に悪影響を及ぼすと報告されている。シュウ酸カルシウム(CaOx)腎臓結石のフォーマーからの循環単球が、健康な個体14と比較して細胞バイオエネルギーを抑制していることが以前に報告されている。さらに、CaOx結晶は、細胞の生体エネルギーを減少させ、単球8におけるレドックス恒常性を破壊する。シュウ酸塩が豊富な食事の摂取は、腎尿細管損傷を引き起こし、腎臓結石形成に対して保護されている尿中高分子の産生および機能を変える可能性のある結晶尿素を引き起こす可能性がある15,16。いくつかの研究は尿の結晶が尿のpHおよび温度に応じて形および大きさを変えることができることを実証した17,18,19.また、尿タンパク質は結晶挙動20を調節することが示されている。Daudon et al.19は、結晶管内分析が腎臓結石疾患患者の管理および治療に対する応答の評価に役立つ可能性があることを提案した。結晶の存在を評価するために現在利用可能ないくつかの従来の方法は、偏光顕微鏡21、22、電子顕微鏡23、粒子カウンター3、尿濾過24、蒸発3、5または遠心分離21を含む。これらの研究は、結晶に関する腎臓結石分野に貴重な洞察を提供してきました。しかし、これらの方法の限界は、1μm未満の結晶のサイズを視覚化して定量できないことでした。このサイズの結晶は、ランドールのプラークに付着することにより、CaOx石の成長に影響を与える可能性があります。

ナノ結晶は、より大きな微結晶25と比較して腎細胞に広範な傷害を引き起こすことが示されている。ナノ結晶の存在は、ナノ粒子分析装置26,27を用いて尿中に報告されている。最近の研究では、蛍光標識ビスリン酸プローブ(アレンドロネート-フルオレセイン/アレンドロネート-Cy5)を用いてナノスケールフローサイトメトリー28を用いてナノ結晶を調べる。この染料の制限は、それが特異的ではなく、システインを除く石のほとんどすべてのタイプに結合することです。したがって、個人におけるナノ結晶の存在を正確に評価することは、結晶を診断したり、石のリスクを予測したりするのに有効なツールとなり得る。本研究の目的は、ナノ粒子追跡解析(NTA)を用いて、ナノ結晶を含むカルシウム(<1μmの大きさ)を検出し、定量化することであった。これを達成するために、NTA技術をカルシウム結合フルオロフォア、Fluo-4 AMと組み合わせて使用し、健康な成人の尿中のナノ結晶を含むカルシウムを検出し定量しました。

Protocol

この研究で概説されたすべての実験は、アラバマ大学バーミンガム校(UAB)制度審査委員会によって承認されました。健康な成人(33.6±3.3歳;n=10)は、正常な血液包括代謝パネル、非タバコユーザー、非妊娠者、20〜30kg/m2のBMI、および慢性病状または急性疾患がない場合、研究に登録された。健康な参加者は、研究開始前に書面によるインフォームド・コンセント・フォームに署名しまし?…

Representative Results

この研究結果から、NTAはヒト尿中の尿中のナノ結晶を含むカルシウムの平均サイズと濃度を効率的に検出できることを示している。これは、フルオロフォア、フルオ4 AM、ナノ粒子追跡解析を用いて達成した。Fluo-4 AMはCaOxとCaPの両方の結晶に結合することができた。図3Aに示すように、CaOx結晶は50〜270nmの大きさであり、平均濃度は1.26 x 109粒子/mLであると判断し?…

Discussion

NTAは、カルシウム結合プローブFluo-4 AMを用いてヒト尿中のナノ結晶を評価するために本研究で使用されている。尿中のナノ結晶を検出するための標準的な方法はありません。いくつかの研究グループは尿中のナノ結晶を検出し、サンプル27、28を定量化する能力に制限されている広範なプロトコルまたは方法の使用に依存している。この研究は、高?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、すべての研究参加者とUAB CCTSバイオニュートリションコアとUAB高解像度イメージングサービスセンターの貢献に感謝しています。この研究は、NIH助成金DK106284とDK123542(TM)、UL1TR003096(国立トランスレーショナルサイエンス推進センター)によって支援されました。

Materials

Benchtop Centrifuge Jouan Centrifuge CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate Synthesized in the lab as previously described29. Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) Sigma 677418 Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol Fischer Scientific AC615095000 Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM* AAT Bioquest, Inc. 20550 Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles Sigma 742031 Store at 2-8°C
NanoSight Instrument Malvern Instruments, UK NS300
Syringe pump Harvard Apparatus 98-4730
Virkon Disinfectant LanXESS Energizing Company, Germany LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.
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Keywords: Urinary NanocrystalsCalcium Fluorophore LabelingNanoparticle Tracking AnalysisKidney Stone FormationCrystal UreaOxalate LoadUrine PHUrine VolumeCalcium OxalateCalcium PhosphateFluo-4 AMGold NanoparticlesNanoparticle Tracking Analysis (NTA)
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Kumar, P., Bell, A., Mitchell, T. Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis. J. Vis. Exp. (168), e62192, doi:10.3791/62192 (2021).
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