Оценка мочевых нанокристаллов у людей с использованием маркировки флуорофора кальция и анализа отслеживания наночастиц

Summary

Цель этого исследования состояла в том, чтобы определить, может ли анализ отслеживания наночастиц (NTA) обнаружить и количественно оценить мочевой кальций, содержащий нанокристалл, у здоровых взрослых. Результаты текущего исследования показывают, что NTA может быть потенциальным инструментом для оценки нанокристаллов мочи при почечнокаменной болезни.

Abstract

Камни в почках становятся все более распространенными во всем мире у взрослых и детей. Наиболее распространенный тип камней в почках состоит из кристаллов оксалата кальция (CaOx). Кристаллурия возникает, когда моча перенасыщена минералами (например, кальцием, оксалатом, фосфатом) и предшествует образованию камней в почках. Стандартные методы оценки кристаллурии в камнеобмениках включают микроскопию, фильтрацию и центрифугирование. Однако эти методы в первую очередь обнаруживают микрокристалл, а не нанокристалл. Было высказано предположение, что нанокристаллы более вредны для эпителиальных клеток почек, чем микрокристаллы in vitro. Здесь мы описываем способность анализа отслеживания наночастиц (NTA) обнаруживать нанокристаллы мочи человека. Здоровых взрослых кормили контролируемой оксалатной диетой перед употреблением оксалатной нагрузки для стимуляции мочевых нанокристаллов. Моча собиралась в течение 24 часов до и после оксалатной нагрузки. Образцы обрабатывали и промывали этанолом для очистки образцов. Мочевые нанокристаллы окрашивали кальцийсвязывающим флуорофором Fluo-4 AM. После окрашивания размер и количество нанокристаллов определяли с помощью NTA. Результаты этого исследования показывают, что NTA может эффективно обнаруживать нанокристаллурию у здоровых взрослых. Эти данные свидетельствуют о том, что NTA может быть ценным методом раннего выявления нанокристаллурии у пациентов с почечнокаменной болезнью.

Introduction

Мочевые кристаллы образуются, когда моча становится перенасыщенной минералами. Это может произойти у здоровых людей, но чаще встречается у людей с камнями в почках^1. Наличие и накопление кристаллов в моче может увеличить риск развития камня в почках. В частности, это происходит, когда кристаллы связываются с бляшкой Рэндалла, нуклеат, накапливаются и растут с течением^{времени 2,3,4.} Кристаллурия предшествует образованию камней в почках и оценка кристаллурии может иметь прогностическое значение у камнеобразовательных почек^3,5. В частности, было предложено, чтобы кристаллурия была полезна для прогнозирования риска рецидива камней у пациентов с анамнезом оксалата кальция, содержащего камни^6,7.

Сообщалось, что кристаллы негативно влияют на функцию почечных эпителиальных и циркулирующих иммунных клеток^{8,9,10,11,12,13.} Ранее сообщалось, что циркулирующие моноциты из камнеуловителей оксалата кальция (CaOx) подавляют клеточную биоэнергетику по сравнению со здоровыми людьми^14. Кроме того, кристаллы CaOx снижают клеточную биоэнергетику и нарушают окислительно-восстановительный гомеостаз в моноцитах^8. Потребление пищи, богатой оксалатами, может вызвать кристаллурию, которая может привести к повреждению почечных канальцев и изменить выработку и функцию макромолекул в моче, которые защищают от образования камней в почках^15,16. Несколько исследований показали, что мочевые кристаллы могут различаться по форме и размеру в зависимости от рН и температуры мочи^17,18,19. Кроме того, было показано, что мочевые белки модулируют поведение кристаллов^20. Daudon et al.¹⁹предположили, что анализ кристаллурии может быть полезен в ведении пациентов с почечнокаменной болезнью и в оценке их реакции на терапию. Несколько традиционных методов, доступных в настоящее время для оценки присутствия^{кристаллов,}включают поляризованную микроскопию^{21,22, электронную}микроскопию^23,счетчики частиц^3,фильтрацию мочи^24,испарение^3,5 или центрифугирование^21. Эти исследования дали ценную информацию о области камней в почках относительно кристаллурии. Однако ограничением этих методов была неспособность визуализировать и количественно оценивать кристаллы размером менее 1 мкм. Кристаллы такого размера могут влиять на рост камней CaOx, прикрепляясь к бляшке Рэндалла.

Было показано, что нанокристаллы вызывают обширное повреждение почечных клеток по сравнению с более крупными микрокристаллами^25. Сообщалось о присутствии нанокристаллов в моче с использованием анализатора наночастиц^26,27. Недавние исследования использовали флуоресцентно меченые бисфосфатные зонды (алендронат-флуоресцеин/алендронат-Cy5) для изучения нанокристаллов с использованием наноразмерной проточной цитометрии^28. Ограничение этого красителя заключается в том, что он не является специфическим и будет связываться практически со всеми типами камней, кроме цистеина. Таким образом, точная оценка присутствия нанокристаллов у людей может быть эффективным инструментом для диагностики кристаллурии и/или прогнозирования риска камней. Целью этого исследования было обнаружение и количественная оценка нанокристаллов кальция (размером <1 мкм) с использованием анализа отслеживания наночастиц (NTA). Для достижения этой цели технология NTA использовалась в сочетании с кальцийсвязывающим флуорофором Fluo-4 AM для обнаружения и количественной оценки нанокристаллов кальция, содержащих в моче здоровых взрослых.

Protocol

Все эксперименты, описанные в этой работе, были одобрены Советом по институциональному обзору Университета Алабамы в Бирмингеме (UAB). Здоровые взрослые (33,6 ± 3,3 года; n = 10) были включены в исследование, если у них была нормальная комплексная метаболическая панель крови, не употребляли таб?…

Representative Results

Результаты этого исследования показывают, что NTA может эффективно обнаруживать средний размер и концентрацию кальция, содержащего нанокристаллы мочи в моче человека. Это было достигнуто с помощью анализа флуорофора, Fluo-4 AM и отслеживания наночастиц. Fluo-4 AM был способен связываться как с…

Discussion

NTA был использован в настоящем исследовании для оценки нанокристаллов в моче человека с использованием кальцийсвязывающего зонда Fluo-4 AM. Не существует стандартного метода обнаружения нанокристаллов в моче. Некоторые исследовательские группы обнаружили нанокристалла в моче и полагал?…

Materials

Benchtop Centrifuge	Jouan Centrifuge	CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate	Synthesized in the lab as previously described29.		Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)	Sigma	677418	Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol	Fischer Scientific	AC615095000	Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles	Sigma	742031	Store at 2-8°C
NanoSight Instrument	Malvern Instruments, UK	NS300
Syringe pump	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon Disinfectant	LanXESS Energizing Company, Germany	LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.