فحص الببتيدات التي تنشط MRGPRX2 باستخدام خلايا HEK المهندسة
Summary
يتم وصف تقنيات إنشاء مكتبة من الببتيدات القصيرة التي يمكن تنشيط الخلايا السارية عن طريق مستقبلات MRGPRX2. التقنيات المرتبطة سهلة وغير مكلفة ، ويمكن تمديدها إلى مستقبلات الخلايا الأخرى.
Abstract
تحديد ligands محددة لمستقبلات الخلايا ذات الأهمية العلاجية أمر بالغ الأهمية بالنسبة للعديد من التطبيقات، بما في ذلك تصميم وتطوير علاجات جديدة. ماس ذات الصلة G-البروتين مستقبلات X2 (MRGPRX2) هو مستقبل مهم ينظم تنشيط الخلايا الصاري، وبالتالي، يوجه الاستجابة المناعية العامة. وقد تم تحديد العديد من الليجاندات لMRGPRX2 وتشمل الببتيدات الذاتية مثل PAMPs، defensins، LL-37 وغيرها من شظايا البروتين (أي، الألبومين المتدهورة). ويتطلب تحديد المزيد من الليجاندات المحددة MRGPRX2 فحص عدد كبير من الببتيدات (أي مكتبة الببتيد)؛ ومع ذلك، الخلايا الصاري صعبة ومكلفة للحفاظ على في المختبر، وبالتالي، ليست اقتصادية لاستخدامها لفحص أعداد كبيرة من الجزيئات. توضح هذه الورقة طريقة لتصميم وتطوير وفحص مكتبة من جزيئات الببتيد الصغيرة باستخدام MRGPRX2 التي تعبر عن خلايا HEK. هذا الخط الخلية سهلة نسبيا وغير مكلفة للحفاظ على ويمكن استخدامها لتحليل عالية الإنتاجية في المختبر. تم استخدام صبغة فلورية حساسة للكالسيوم Fura-2 لوضع علامة على تدفق الكالسيوم داخل الخلايا عند التنشيط لمراقبة التنشيط. واستخدمت نسبة كثافة الفلورية من Fura-2 في 510 نانومتر ضد أطوال موجية الإثارة من 340 و 380 نانومتر لحساب تركيز الكالسيوم. كانت مكتبة الببتيد المستخدمة للتحقق من هذا النظام تستند إلى الإفرازات الذاتية Proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) ، والتي من المعروف أنها تربط MRGPRX2 بخصوصية وتقارب عاليين. تم إنشاء الببتيدات اللاحقة من خلال اقتطاع الأحماض الأمينية وتقنيات مسح ألانين المطبقة على PAMP-12. الطريقة الموصوفة هنا بسيطة وغير مكلفة ولكنها قوية لفحص مكتبة كبيرة من المركبات لتحديد نطاقات الربط والمعلمات الهامة الأخرى التي تلعب دورا هاما في تنشيط المستقبلات.
Introduction
الخلايا الصاري هي جزء لا يتجزأ من الجهاز المناعي وتلعب دورا حاسما في كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. يتم تنشيط الخلايا الصاري في المقام الأول إما عن طريق ربط مستضد للغلوبولين المناعي E (IgE) – مجمع مستقبلات FcεRI ، أو بواسطة ماس المكتشفة مؤخرا ذات الصلة G-البروتين مستقبلات X2 (MRGPRX2)1. وقد تم ربط تنشيط MRGPRX2 إلى العديد من الأمراض المناعية والالتهابية، وبالتالي، من المهم أن نفهم آلية ملزمة للمستقبلات إلى ليغاندس2. للقيام بذلك ، تم تطوير مكتبة من جزيئات الببتيد الصغيرة وفحصها ضد مستقبلات MRGPRX2 التي تم التعبير عنها بشكل مفرط في خلايا HEK. في الدراسة، تم بناء مكتبة الببتيد باستخدام تقنيات بسيطة ومتعددة الاستخدامات لمسح ألانين واقتطاع الأحماض الأمينية. يتضمن مسح ألانين استبدال الأحماض الأمينية المحددة ببقايا ألانين. ألانين يجري صغيرة ومحايدة، يجرد الببتيد من خصائص محددة التي تمنحها بقايا استبدال ويسلط الضوء على التوالي على أهمية الخصائص الفيزيائية الكيميائية لكل من الأحماض الأمينية في التفاعلات مستقبلات. على العكس من ذلك، في اقتطاع الأحماض الأمينية، تم تصميم تسلسل الببتيد بحيث يفتقر إلى واحد أو أكثر من بقايا الأحماض الأمينية من محطة N، محطة C، أو كليهما. تم استخدام هذه المجموعة من الببتيدات لتحديد تسلسل الأحماض الأمينية الحاسمة لربط MRGPRX2.
وقد أظهرت تجربة مع خطوط الخلايا الصاري البشري (LAD-2) أن هذه الخلايا من الصعب على الثقافة والحفاظ على في المختبر: مضاعفة الوقت لمدة أسبوعين, ملاحق متوسطة مكلفة, والاهتمام المباشر المطلوب أثناء passaging3. هذه السمات تجعل الخلايا غير مناسبة لفحص واسع النطاق من الليغاند المحتملة. هنا، استخدمت خلايا HEK المصابة بشكل ثابت التي تعبر عن مستقبلات MRGPRX2 (HEK-X2) لفحص مكتبة الببتيد1. وتستخدم على نطاق واسع HEK-293 خلايا ودرس للتعبير heterologous من مستقبلات السطح بسبب كفاءتها عالية transfection, معدل مضاعفة أسرع, والحاجة إلى المكملات الغذائية المتوسطة غير مكلفة أن تكون مثقفة في المختبر4. وقد ثبت البروتوكول إلى خط الخلية HEK-293 transfect وراسخة5. تم تنشيط خلايا HEK-293 التي تعبر بشكل ثابت عن مستقبلات MRGPRX2 (الممر 13-19) مع الببتيدات المتولدة من خلال الاقتطاع N ، C-truncation ، N + C -truncation ، ومسح ألانين1. استخدمت خلايا HEK البرية من النوع (HEK-WT) (الممر 16-21) كتحكم. تم رصد إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا عند التنشيط لدراسة التنشيط القائم على MRGPRX2.
ويتبع تنشيط الخلية من قبل MRGPRX2 تعبئة الكالسيوم السيتوسوليك. وينظم هذا الإفراج عن الكالسيوم داخل الخلايا المنظمة في الخلايا الصاري من قبل مخزن تشغيل إدخال الكالسيوم (SOCE), منسقة من قبل جزيء التفاعل سترومال 1 (STIM1); وهو مركزي لسلسلة الاستجابة المناعية6،7. وقد استخدمت أساليب مختلفة للكشف عن تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، بما في ذلك التصحيح المشابك والأصباغ الفلورية8. من بين جميع التقنيات المتاحة ، يتم استخدام أصباغ الكالسيوم الفلورية في اقترانها بتقنيات الكشف المختلفة على نطاق واسع9. نوعان من الأصباغ الفلورية التي اكتسبت مصالح هي، الأصباغ الطول الموجي واحد مثل فلوو-4، والأصباغ نسبة الطول الموجي المزدوج مثل الهند -1 وفورا-2. الميزة التي تجلب الأصباغ نسبة الطول الموجي المزدوج أكثر من الأصباغ الطول الموجي واحد هو أن الأصباغ ratiometric الصحيح للأخطاء التجريبية مثل تحميل صبغة، تبييض الصور، والتركيز10،11.
Fura-2 أستر أسيتوكسي ميثيل (Fura-2 AM) هي خلية تتخللها صبغة خضراء فلورية يتحول الإثارة إلى طول موجي أقل عند ربط الكالسيوم. من الناحية التجريبية، Fura-2 متحمس في 340 و 380 نانومتر، في حين يتم تسجيل الانبعاثات في 510 نانومتر. عند ربط الكالسيوم، تزداد كثافة الفلورسنت عند 340 نانومتر بينما تنخفض كثافة 380 نانومتر، كما هو موضح في الشكل 1. يتم تمثيل البيانات كنسبة من كثافة الفلورسينس بعد الإثارة عند 340 نانومتر (F340) إلى كثافة بعد الإثارة عند 380 نانومتر (F380) أي F340/F380. تتناسب نسبة F340/F380 مع الكالسيوم داخل الخلايا، والتي يمكن حساب قيمتها من خلال معادلة Grynkiewicz12. منذ يتم الحصول على إشارة مضان من إثارة الصبغة في اثنين من الأطوال الموجية (340 نانومتر و 380 نانومتر)، ونسبة إشارات مضان يصحح لعوامل تجريبية مثل تحميل صبغة، تسرب صبغ، photobleaching، وكثافات الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إشارات الكالسيوم أمر مركزي ل degranulation الخلايا الصاري، وقد استخدمت على نطاق واسع في دراسة التفاعلات مستقبلات ليغاند, تحديد ligand, واكتشاف المخدرات14. MRGPRX2 هو مستقبلات الخلايا الصاري المكتشفة مؤخرا التي تم العثور عليها للعب دور رئيسي في العديد من الأمراض الالتهابية مثل الحكة والرب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ريال وLDU ترغب في الاعتراف ألبرتا يبتكر مشروع البحوث الاستراتيجية، NRC، وNSERC-ديسكفري منحة لهذا المشروع.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
