Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2'i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır
Summary
MRGPRX2 reseptörü ile mast hücrelerini aktive edebilecek kısa peptitlerden oluşan bir kütüphane oluşturma teknikleri açıklanmıştır. İlişkili teknikler kolay, ucuzdur ve diğer hücre reseptörlerine genişletilebilir.
Abstract
Terapötik olarak önemli hücre reseptörlerine özgü ligandların tanımlanması, yeni terapötiklerin tasarımı ve geliştirilmesi de dahil olmak üzere birçok uygulama için çok önemlidir. Mas ile ilişkili G-protein reseptörü-X2 (MRGPRX2), mast hücre aktivasyonunu düzenleyen ve böylece genel immün yanıtı yönlendiren önemli bir reseptördür. MRGPRX2 için çok sayıda ligand tanımlanmıştır ve PAMP’ler, defensinler, LL-37 ve diğer protein parçaları (yani bozulmuş albümin) gibi endojen peptitleri içerir. MRGPRX2 spesifik ligandların daha fazla tanımlanması, çok sayıda peptitin (yani peptit kütüphanesinin) taranmışlığını gerektirir; bununla birlikte, mast hücrelerinin in vitro olarak tutulması zor ve pahalıdır ve bu nedenle çok sayıda molekülün taranması için kullanılması ekonomik değildir. Bu makale, HEK hücrelerini ifade eden MRGPRX2 kullanarak küçük peptit moleküllerinden oluşan bir kütüphane tasarlamak, geliştirmek ve taramak için bir yöntem göstermektedir. Bu hücre hattının bakımı nispeten kolay ve ucuzdur ve in vitro yüksek verim analizi için kullanılabilir. Aktivasyonu izlemek için aktivasyon üzerine hücre içi kalsiyum akısını işaretlemek için kalsiyuma duyarlı fura-2 floresan boya kullanıldı. Kalsiyum konsantrasyonunu hesaplamak için 510 nm’de Fura-2’nin floresan yoğunluğunun 340 ve 380 nm’lik ekscitasyon dalga boylarına karşı oranı kullanılmıştır. Bu sistemi doğrulamak için kullanılan peptit kütüphanesi, MRGPRX2’yi yüksek özgüllük ve benzeşim ile bağladığı bilinen endojen proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) salgıya dayanıyordu. Pamp-12’ye uygulanan amino asit kesilmesi ve alanin tarama teknikleri ile sonraki peptitler üretildi. Burada açıklanan yöntem, bağlayıcı etki alanlarını ve reseptör aktivasyonunda önemli rol oynayan diğer önemli parametreleri tanımlamak için büyük bir bileşikler kitaplığını taramak için basit ve ucuz ancak sağlamdır.
Introduction
Mast hücreleri bağışıklık sisteminin ayrılmaz bir parçasıdır ve hem doğuştan gelen hem de adaptif immün yanıtlarda çok önemli bir rol oynar. Mast hücreleri öncelikle bir antijenin immünoglobulin E (IgE) – FcφRI reseptör kompleksine bağlanması veya yakın zamanda keşfedilen mas ile ilgili G-protein reseptörü-X2 (MRGPRX2)1ile aktive edilir. MRGPRX2 aktivasyonu birkaç bağışıklık ve enflamatuar hastalığa bağlanmıştır ve bu nedenle reseptörün ligandlarına bağlanma mekanizmasını anlamak önemlidir2. Bunun için, HEK hücrelerinde aşırı ifade edilen MRGPRX2 reseptörlerine karşı küçük peptit moleküllerinden oluşan bir kütüphane geliştirildi ve tarandı. Çalışmada peptit kütüphanesi alanin taraması ve amino asit kesilmesinin basit ve çok yönlü teknikleri kullanılarak inşa edilmiştir. Alanin taraması, spesifik amino asitlerin alanin kalıntısı ile değiştirilmesini içerir. Alanin küçük ve nötr olmak, değiştirilen kalıntı tarafından verilen belirli özelliklerin peptidini sıyırır ve reseptör etkileşimlerinde amino asidin ilgili fizyokimyasal özelliklerinin önemini ardışık olarak vurgular. Aksine, amino asit kesilmesinde, peptit dizileri N terminali, C terminali veya her ikisinden bir veya daha fazla amino asit kalıntısından yoksun olacak şekilde tasarlanmıştır. Bu peptit seti MRGPRX2 bağlanması için çok önemli olan amino asit dizilerini tanımlamak için kullanıldı.
İnsan mast hücreleri hatları (LAD-2) ile deneyim, bu hücrelerin in vitrokültür ve bakımının zor olduğunu göstermiştir: iki haftalık bir iki katlama süresi, pahalı orta takviyeler ve geçiş sırasında doğrudan dikkat3. Bu özellikler, hücreleri potansiyel ligandların büyük ölçekli taraması için uygun hale getirir. Burada, peptit kütüphanesini taramak için MRGPRX2 reseptörü (HEK-X2) ifade eden stably transfected HEK hücreleri kullanılmıştır1. HEK-293 hücreleri, yüksek transeksiyon verimliliği, daha hızlı iki katına çıkma oranı ve pahalı olmayan orta takviyelerin laboratuvarda kültüre edilmesi ihtiyacı nedeniyle yüzey reseptörlerinin heterolog ifadesi için yaygın olarak kullanılır ve çalışılmıştır4. HEK-293 hücre hattının transfect protokolü gösterilmiştir ve iyi kurulmuştur5. MRGPRX2 reseptörü (pasaj 13-19) saplı olarak ifade eden HEK-293 hücreleri, N-truncation, C-truncation, N+C-truncation ve alanine scanning1yoluyla oluşturulan peptitlerle aktive edildi. Kontrol olarak yabani tip HEK hücreleri (HEK-WT) (pasaj 16-21) kullanılmıştır. MRGPRX2 bazlı aktivasyonu incelemek için aktivasyon üzerine hücre içi kalsiyum salınımı izlendi.
MRGPRX2 ile hücre aktivasyonunu sitozolitik kalsiyum mobilizasyon takip edilir. Mast hücrelerindeki bu düzenlenmiş hücre içi kalsiyum salınımı, stromal etkileşim molekülü 1 (STIM1) tarafından koordine edilen depo tarafından işletilen kalsiyum girişi (SOCE) tarafından düzenlenir; ve immün yanıt basamak6,7merkezidir. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu tespit etmek için yama kelepçeleri ve floresan boyalar8dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Mevcut tüm teknikler arasında, çeşitli algılama teknikleri ile konjugasyonda florometrik kalsiyum boyaları yaygın olarak kullanılmaktadır9. İlgi gören iki tip florometrik boya, yani Fluo-4 gibi tek dalga boyu boyaları ve Hint -1 ve Fura-2 gibi çift dalga boyu oranmetrik boyalarıdır. Çift dalga boyu oransal boyaların tek dalga boyu boyaları üzerine getirdiği avantaj, oranmetrik boyaların boya yükleme, fotoğraf ağartma ve odaklama10,11gibi deneysel hatalar için doğru olmasıdır.
Fura-2 asetoksimetil ester (Fura-2 AM), kalsiyum bağlayıcılığı üzerine eksitasyonu daha düşük bir dalga boylarına kayan, yeşil floresan bir hücredir. Deneysel olarak, Fura-2 340 ve 380 nm’de heyecanlanırken, emisyon 510 nm’de kaydedilir. Kalsiyum bağlanması üzerine, Şekil 1’degösterildiği gibi, 340 nm’deki floresan yoğunluğu artarken, 380 nm azalır. Veriler, 340 nm’de (F340) heyecanlandıktan sonra floresan yoğunluğunun 380 nm’de (F380) yani F340/F380’de heyecanlandıktan sonraki yoğunluğa oranı olarak temsil edilir. F340/F380 oranı, değeri Grynkiewicz denklemi12ile hesaplanabilen hücre içi kalsiyum ile orantılıdır. Floresan sinyali boyanın iki dalga boyunda (340 nm ve 380 nm) çıkarılmasından elde edildiğinden, floresan sinyallerinin oranı boya yükleme, boya kaçağı, fotobleaching ve hücre yoğunlukları gibi deneysel faktörler için düzeltir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kalsiyum sinyali mast hücre degranülasyonu için merkezidir ve reseptör-ligand etkileşimleri, ligand tanımlama ve ilaç keşfi çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır14. MRGPRX2, kaşıntı, astım ve atopik dermatit gibi birçok enflamatuar hastalıkta önemli bir rol oynadığı tespit edilen yakın zamanda keşfedilen bir mast hücre reseptörüdür2. Ayrıca, mrgprx2 reseptör15aracılığıyla enflamatuar yanıt ortaya çıkarm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SR ve LDU, Alberta Innovates Stratejik Araştırma Projesi, NRC ve NSERC-Discovery’nin bu proje için hibesini kabul etmek istiyor.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
