工学的HEK細胞を用いたMRGPRX2を活性化するペプチドのスクリーニング
Summary
MRGPRX2受容体を介してマスト細胞を活性化できる短いペプチドのライブラリーを生成する技術が記載されている。関連する技術は、容易で安価であり、他の細胞受容体に拡張することができる。
Abstract
治療上重要な細胞受容体に特異的なリガンドを同定することは、新しい治療薬の設計と開発を含む多くの用途にとって極めて重要である。マス関連Gタンパク質受容体X2(MRGPRX2)は、肥満細胞の活性化を調節する重要な受容体であり、したがって、一般的な免疫応答を導く。MRGPRX2に対する多数のリガンドが同定されており、PMP、ディフェンシン、LL-37および他のタンパク質断片(すなわち、分解されたアルブミン)のような内因性ペプチドが含まれる。MRGPRX2特異的リガンドのさらなる同定には、多数のペプチド(すなわち、ペプチドライブラリー)のスクリーニングが必要である。しかし、肥満細胞は インビトロ で維持するのが難しく高価であり、したがって、多数の分子をスクリーニングするために使用することは経済的ではない。本論文は、MRGPRX2を用いてHEK細胞を発現する小ペプチド分子のライブラリーを設計、開発、およびスクリーニングする方法を示す。この細胞株は維持するために比較的容易で安価であり 、in vitro ハイスループット分析に使用することができる。活性化時に細胞内カルシウムフラックスをマークするカルシウム感受性フラ2蛍光色素を使用して、活性化を監視した。340nmおよび380nmの励起波長に対する510nmにおけるフラ-2の蛍光強度の比を用いてカルシウム濃度を算出した。このシステムを検証するために使用されるペプチドライブラリーは、内因性のproadrenomedullin N末端12(PAMP-12)分泌基化に基づいており、MRGPRX2を高い特異性および親和性で結合することが知られている。その後のペプチドは、PAMP-12に適用されるアミノ酸切り捨ておよびアラニンスキャン技術を介して生成された。ここで説明する方法は、結合ドメインおよび受容体活性化において重要な役割を果たす他の重要なパラメータを同定するために、化合物の大規模なライブラリをスクリーニングするための簡単で安価でありながら堅牢である。
Introduction
マスト細胞は免疫系の不可欠な部分であり、自然免疫応答と適応免疫応答の両方で重要な役割を果たしています。マスト細胞は、主に免疫グロブリンE(IgE)-FcεRI受容体複合体への抗原の結合によって、または最近発見されたマス関連Gタンパク受容体-X2(MRGPRX2)1によって活性化される。MRGPRX2活性化はいくつかの免疫疾患および炎症性疾患に関連しており、したがって、受容体のリガンド2への結合機構を理解することが重要である。そのために、HEK細胞で過剰発現したMRGPRX2受容体に対して、小ペプチド分子のライブラリーが開発され、スクリーニングされた。研究では、ペプチドライブラリーは、アラニンスキャンとアミノ酸切り捨ての単純で汎用性の高い技術を使用して構築されました。アラニンスキャンは、アラニン残基に特定のアミノ酸を置き換えることを含みます.アラニンは小さく中性であり、置換された残基によって与えられた特定の特性のペプチドを取り除き、受容体相互作用におけるアミノ酸のそれぞれの生理化学的性質の重要性を連続的に強調する。逆に、アミノ酸切り捨てでは、ペプチド配列は、N末端、C末端、またはその両方から1つ以上のアミノ酸残基を欠くように設計されている。この一組のペプチドは、MRGPRX2結合に重要なアミノ酸配列を同定するために使用された。
ヒト肥満細胞株(LAD-2)の経験は、これらの細胞が培養およびインビトロを維持することが困難であることを示している:2週間の倍増時間、高価な培地サプリメント、および過ごす間に必要な直接的な注意3。これらの属性は、潜在的なリガンドの大規模スクリーニングに適さない細胞を作る。本明細書において、MRGPRX2受容体(HEK-X2)を発現する安定的にトランスフェクトされたHEK細胞を、ペプチドライブラリー1をスクリーニングするために使用した。HEK-293細胞は、その高いトランスフェクション効率、より速い倍率、および実験室4で培養される非高価な培地サプリメントの必要性による表面受容体の異種発現のために広く使用され、研究されている。HEK-293細胞株をトランスフェクトするプロトコルが実証されており、5.MRGPRX2受容体を安定的に発現するHEK-293細胞(継代13-19)は、N-切り捨て、C-切り捨て、N+C切り捨て、およびアラニン走査1を介して生成されたペプチドで活性化された。野生型HEK細胞(HEK-WT)(継代16-21)をコントロールとして用いた。活性化時に細胞内カルシウム放出をモニターし、MRGPRX2に基づく活性化を研究した。
MRGPRX2による細胞活性化は、続いて細胞分解性カルシウム動員を行う。肥満細胞におけるこの調節された細胞内カルシウム放出は、貯蔵操作カルシウムエントリー(SOCE)によって調節され、間質相互作用分子1(STIM1)によって調整される。免疫応答カスケード6、7の中心である。パッチクランプや蛍光色素8を含む、細胞内カルシウム濃度の検出には様々な方法が用いられている。利用可能なすべての技術のうち、各種検出技術による共役における蛍光カルシウム色素が広く用いられている9.関心を集めた2種類の蛍光色素は、Fluo-4のような単一波長色素と、Indo -1やFura-2のような二重波長比比色素です。二重波長比比色素が単一波長色素を超える利点は、比比色素が染料のロード、写真の漂白、および焦点10、11のような実験的エラーに対して正しいということです。
フラ2アセトキシメチルエステル(Fura-2 AM)は、カルシウム結合時に励起が低波長にシフトする細胞浸透、緑色蛍光色素です。実験的に、Fura-2は340および380 nmで励起され、放出は510 nmで記録される。カルシウム結合の際、 図1に示すように340nmの蛍光強度は380nmの蛍光強度が低下する一方で減少する。データは、380nm(F380)での励起後の強度に対して340nm(F340)での励起後の蛍光強度の比、すなわちF340/F380として表される。F340/F380比は細胞内カルシウムに比例し、その値はGrynkiewicz式12によって計算することができる。蛍光信号は、色素の励起から得られるので(340nmと380nm)、蛍光信号の比は、染料負荷、染料漏れ、光漂白、および細胞密度などの実験的要因を補正します。
Protocol
Representative Results
Discussion
カルシウムシグナル伝達は、マスト細胞脱顆粒の中心であり、受容体リガンド相互作用、リガンド同定、および創薬14の研究において広く用いられている。MRGPRX2は、かゆみ、喘息、アトピー性皮膚炎などの多くの炎症性疾患において重要な役割を果たしていることが最近発見されたマスト細胞受容体である2。さらに、いくつかの承認された薬物は、MRGPRX2?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SRとLDUは、アルバータ州のイノベーションズ戦略研究プロジェクト、NRC、NSERCディスカバリーの助成金を認め、このプロジェクトに対して認めます。
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
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