엔지니어링 된 HEK 세포를 사용하여 MRGPRX2를 활성화하는 펩티드 스크리닝
Summary
MRGPRX2 수용체를 통해 비만 세포를 활성화할 수 있는 짧은 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 기술이 기재되어 있다. 관련 기술은 쉽고 저렴하며 다른 세포 수용체로 확장 될 수 있습니다.
Abstract
치료적으로 중요한 세포 수용체에 특정 한 리간드를 식별하는 것은 많은 응용 프로그램에 대 한 중요 한, 설계 및 새로운 치료의 개발을 포함 하 여. Mas 관련 G-단백질 수용체-X2 (MRGPRX2)는 마스트 세포 활성화를 조절하고, 따라서, 일반적인 면역 반응을 지시하는 중요한 수용체이다. MRGPRX2에 대한 수많은 리간드가 확인되었으며 PAMPs, 디펜신, LL-37 및 기타 단백질 단편(즉, 저하된 알부민)과 같은 내인성 펩티드를 포함한다. MRGPRX2 특이적 리간드의 추가 식별은 많은 수의 펩타이드(즉, 펩티드 라이브러리)의 스크리닝을 필요로 합니다. 그러나, 비만 세포는 시험관 내에서 유지하기 어렵고 비싸고, 따라서, 분자의 큰 숫자를 선별하기 위해 사용하는 경제적이지. 본 논문은 HEK 세포를 발현하는 MRGPRX2를 사용하여 소형 펩티드 분자 라이브러리를 설계, 개발 및 선별하는 방법을 시연한다. 이 세포주 유지 보수가 비교적 쉽고 저렴하며 체외 고처리량 분석에 사용할 수 있습니다. 활성화 시 세포내 칼슘 플럭스를 표시하는 황라-2 형광염염색제가 활성화를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 340 nm와 380 nm의 난사 파장에 대해 510 nm에서 후라-2의 형광 강도의 비율이 칼슘 농도를 계산하는 데 사용되었습니다. 이 시스템을 검증하는 데 사용되는 펩티드 라이브러리는 MRGPRX2를 높은 특이성과 친화성으로 결합하는 것으로 알려진 내인성 proadrenomedullin N 단자 12 (PAMP-12) 분비학을 기반으로하였다. 후속 펩타이드는 PAMP-12에 적용된 아미노산 잘림질 및 알라닌 스캐닝 기술을 통해 생성되었다. 여기서 설명된 방법은 수용체 활성화에 중요한 역할을 하는 결합 도메인 및 기타 중요한 매개 변수를 식별하기 위해 대규모 화합물 라이브러리를 선별하기 위한 간단하고 저렴하면서도 견고합니다.
Introduction
비만 세포는 면역 계통의 필수적인 부분이고 선천적이고 적응적인 면역 반응 둘 다에 있는 중요한 역할을 합니다. 마스트 세포는 주로 면역글로불린 E(IgE)에 항원의 결합에 의해 활성화- FcθRI 수용체 복합체, 또는 최근에 발견된 Mas 관련 G 단백질 수용체-X2(MRGPRX2)1. MRGPRX2 활성화는 몇몇 면역 및 선동적인 질병에 연결되고, 따라서, 그것의 리간드2에수용체의 결합 기계장치를 이해하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 작은 펩티드 분자의 라이브러리가 개발되었고 HEK 세포에서 과발현된 MRGPRX2 수용체에 대하여 선별되었다. 연구에서 펩티드 라이브러리는 알라닌 스캐닝 및 아미노산 잘림의 간단하고 다재다능한 기술을 사용하여 구성되었다. Alanine 스캐닝은 특정 아미노산을 알라닌 잔류물로 대체하는 것을 포함합니다. 알라닌은 작고 중성인, 대체된 잔류물로 부여되는 특정 성질의 펩티드를 제거하고 연속적으로 수용체 상호작용에서 아미노산의 각각의 생리학적 특성의 중요성을 강조한다. 반대로, 아미노산 잘림착에서 펩티드 서열은 N단, C 단자 또는 둘 다로부터 하나 이상의 아미노산 잔류물이 부족하도록 설계된다. 펩티드의이 세트는 MRGPRX2 결합에 중요한 아미노산 서열을 식별하는 데 사용되었다.
인간 비만 세포 라인 (LAD-2)을 경험하는 것은 이 세포가 시험관 내에서배양하고 유지하기 어렵다는 것을 보여주었습니다 : 2 주, 비싼 중간 보충제 및 통과 시 필요한 직접주의3. 이러한 특성은 세포를 잠재적 인 리간드의 대규모 스크리닝에 적합하지 않게합니다. 본명, MRGPRX2 수용체(HEK-X2)를 발현하는 안정적으로 전염된 HEK 세포가 펩티드 라이브러리1을스크리닝하는 데 사용되었다. HEK-293 세포는 높은 경질 효율, 빠른 이중 속도 및 실험실4에서배양되는 비고가가치 중형 보충제의 필요성으로 인해 표면 수용체의 이종 발현을 위해 널리 사용되고 연구된다. HEK-293 세포주 에 대한 프로토콜이 입증되었으며 잘 확립되어있다 5. HEK-293 세포는 MRGPRX2 수용체(passage 13-19)를 안정적으로 발현하여 N-잘림, C-잘림, N+C-잘림, 알라닌 스캐닝1을통해 생성된 펩티드로 활성화되었다. 야생형 HEK 세포(HEK-WT) (16-21통로)가 대조군으로 사용되었다. 활성화 시 세포 내 칼슘 방출은 MRGPRX2 기반 활성화를 연구하기 위해 모니터링되었다.
MRGPRX2에 의한 세포 활성화는 세포성 칼슘 동원에 선행된다. 비만 세포에서 이러한 조절된 세포내 칼슘 방출은 저장조작 칼슘 항목(SOCE)에 의해 조절되며, 기질 상호작용 분자 1(STIM1)에 의해 조정됨; 면역 반응 의 중심6,7. 패치 클램프 및 형광염료8을포함한 세포내 칼슘 농도를 검출하기 위해 다양한 방법이 사용되어 왔다. 사용 가능한 모든 기술 중, 다양한 검출 기술과 결합에서 형광 칼슘 염료가 널리 사용되고 있다9. 관심을 얻은 두 가지 유형의 불소 염료는 플루오-4와 같은 단일 파장 염료와 인도 -1 및 후라-2와 같은 이중 파장 염료입니다. 이중 파장 염료가 단일 파장 염료를 통해 가져오는 장점은 염료 하중, 사진 표백 및 초점10,11과같은 실험 적 오류에 대한 비율 측정 염료가 정확하다는 것입니다.
후라-2 아세톡시메틸 에스테르(Fura-2 AM)는 칼슘 결합 시 발근이 낮은 파장으로 이동하는 세포 침투, 녹색 형광염입니다. 실험적으로, Fura-2는 340 및 380 nm에서 흥분하고, 방출은 510 nm에서 기록됩니다. 칼슘 결합시, 340 nm의 형광 강도는 380 nm의 감소하는 동안 증가, 도 1에도시된 바와 같이. 데이터는 340nm(F340)에서 380nm(F380) 즉, F340/F380에서 발아 후 강도의 비율로 표현된다. F340/F380 비율은 세포내 칼슘에 비례하며, 그값은 그린키에비츠방정식(12)에의해 계산될 수 있다. 형광 신호는 두 파장 (340 nm 및 380 nm)에서 염료의 외리로부터 수득되기 때문에 형광 신호의 비율은 염료 하중, 염료 누설, 광표백 및 세포 밀도와 같은 실험 적 인 인자를 교정합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
칼슘 신호는 비만 세포 탈과화의 중심이며 수용체 리간드 상호 작용, 리간드 식별 및 약물 발견14의연구에 널리 사용되어 왔다. MRGPRX2는 최근에 발견된 비만 세포 수용체로 가려움증, 천식 및 아토피성 피부염과 같은 많은 염증성 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 그중에서도 2. 더욱이, 몇몇 승인된 약은 MRGPRX2 수용체 를 통해 선동적인 반응을 유…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SR과 LDU는 이 프로젝트에 대한 알버타 혁신 전략 연구 프로젝트, NRC 및 NSERC-Discovery 보조금을 인정하고자 합니다.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
