Detección de péptidos que activan MRGPRX2 utilizando células HEK modificadas
Summary
Se describen técnicas para generar una biblioteca de péptidos cortos que pueden activar los mastocitos a través del receptor MRGPRX2. Las técnicas asociadas son fáciles, económicas y se pueden extender a otros receptores celulares.
Abstract
La identificación de ligandos específicos para receptores celulares terapéuticamente significativos es crucial para muchas aplicaciones, incluido el diseño y desarrollo de nuevas terapias. Mas relacionado con el receptor de proteína G-X2 (MRGPRX2) es un receptor importante que regula la activación de los mastocitos y, por lo tanto, dirige la respuesta inmune general. Se han identificado numerosos ligandos para MRGPRX2 e incluyen péptidos endógenos como PAMPs, defensinas, LL-37 y otros fragmentos de proteínas (es decir, albúmina degradada). La identificación adicional de ligandos específicos de MRGPRX2 requiere la detección de un gran número de péptidos (es decir, biblioteca de péptidos); sin embargo, los mastocitos son difíciles y costosos de mantener in vitro y, por lo tanto, no son económicos de usar para el cribado de un gran número de moléculas. El presente artículo demuestra un método para diseñar, desarrollar y examinar una biblioteca de moléculas peptídicas pequeñas utilizando células HEK que expresan MRGPRX2. Esta línea celular es relativamente fácil y económica de mantener y se puede utilizar para el análisis in vitro de alto rendimiento. Se utilizó un colorante fluorescente Fura-2 sensible al calcio para marcar el flujo de calcio intracelular tras la activación para monitorear la activación. Para calcular la concentración de calcio se utilizó la relación entre la intensidad de fluorescencia de Fura-2 a 510 nm frente a longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm. La biblioteca de péptidos utilizada para verificar este sistema se basó en el secretagogo endógeno proadrenomedulina N-terminal 12 (PAMP-12), que se sabe que se une a MRGPRX2 con alta especificidad y afinidad. Los péptidos posteriores se generaron a través de técnicas de truncamiento de aminoácidos y escaneo de alanina aplicadas a PAMP-12. El método descrito aquí es simple y económico pero robusto para la detección de una gran biblioteca de compuestos para identificar dominios de unión y otros parámetros importantes que juegan un papel importante en la activación del receptor.
Introduction
Los mastocitos son una parte integral del sistema inmunológico y desempeñan un papel crucial en las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los mastocitos se activan principalmente por la unión de un antígeno al complejo receptor de inmunoglobulina E (IgE) – FcεRI, o por el recientemente descubierto receptor de proteína G relacionado con mas-X2 (MRGPRX2)1. La activación de MRGPRX2 se ha relacionado con varias enfermedades inmunes e inflamatorias, y por lo tanto, es importante comprender el mecanismo de unión del receptor a sus ligandos2. Para hacerlo, se desarrolló una biblioteca de pequeñas moléculas peptídicas y se cribó contra los receptores MRGPRX2 que estaban sobreexpresados en las células HEK. En el estudio, la biblioteca de péptidos se construyó utilizando las técnicas simples y versátiles de escaneo de alanina y truncamiento de aminoácidos. La exploración con alanina implica reemplazar aminoácidos específicos con un residuo de alanina. La alanina es pequeña y neutra, despoja al péptido de las propiedades específicas conferidas por el residuo reemplazado y resalta consecutivamente la importancia de las respectivas propiedades fisicoquímicas del aminoácido en las interacciones receptoras. Por el contrario, en el truncamiento de aminoácidos, las secuencias peptídicas están diseñadas de tal manera que carecen de uno o más residuos de aminoácidos del terminal N, terminal C o ambos. Este conjunto de péptidos se utilizó para identificar las secuencias de aminoácidos cruciales para la unión a MRGPRX2.
La experiencia con líneas de mastocitos humanos (LAD-2) ha demostrado que estas células son difíciles de cultivar y mantener in vitro:un tiempo de duplicación de dos semanas, costosos suplementos medios y atención directa requerida durante el paso3. Estos atributos hacen que las células no sean adecuadas para el cribado a gran escala de ligandos potenciales. Aquí, se utilizaron células HEK transfectadas de manera estable que expresan el receptor MRGPRX2 (HEK-X2) para examinar la biblioteca de péptidos1. Las células HEK-293 son ampliamente utilizadas y estudiadas para la expresión heteróloga de receptores de superficie debido a su alta eficiencia de transfección, tasa de duplicación más rápida y la necesidad de que se culticen suplementos medios no costosos en laboratorio4. El protocolo para transfectar la línea celular HEK-293 ha sido demostrado y está bien establecido5. Las células HEK-293 que expresan de manera estable el receptor MRGPRX2 (paso 13-19) se activaron con los péptidos generados a través del N-truncamiento, C-truncamiento, N+C-truncamiento y escaneo de alanina1. Se utilizaron células HEK de tipo salvaje (HEK-WT) (paso 16-21) como control. La liberación intracelular de calcio tras la activación fue monitoreada para estudiar la activación basada en MRGPRX2.
La activación celular por MRGPRX2 es seguida por una movilización de calcio citosólico. Esta liberación de calcio intracelular regulada en los mastocitos está regulada por la entrada de calcio operada por almacenamiento (SOCE), coordinada por la molécula de interacción estromal 1 (STIM1); y es central en la cascada de respuesta inmune6,7. Se han utilizado varios métodos para detectar la concentración de calcio intracelular, incluyendo pinzas de parche y colorantes fluorescentes8. De todas las técnicas disponibles, los colorantes fluorométricos de calcio en conjugación con diversas técnicas de detección están siendo ampliamente utilizados9. Dos tipos de colorantes fluorométricos que han ganado interés son, a saber, los tintes de longitud de onda única como Fluo-4, y los tintes de relación de longitud de onda dual como Indo-1 y Fura-2. La ventaja que aportan los tintes ratiométricos de doble longitud de onda sobre los tintes de longitud de onda única es que los tintes ratiométricos corrigen errores experimentales como la carga del tinte, el fotoblanqueo y el enfoque10,11.
El éster acetoximetílico fura-2 (Fura-2 AM) es un colorante verde-fluorescente penetrante en las células cuya excitación cambia a una longitud de onda más baja al unirse al calcio. Experimentalmente, Fura-2 se excita a 340 y 380 nm, mientras que la emisión se registra a 510 nm. Tras la unión al calcio, la intensidad fluorescente a 340 nm aumenta mientras que la de 380 nm disminuye, como se muestra en la Figura 1. Los datos se representan como una relación entre la intensidad de fluorescencia después de la excitación a 340 nm (F340) y la intensidad después de la excitación a 380 nm (F380), es decir, F340 / F380. La relación F340/F380 es proporcional al calcio intracelular, cuyo valor se puede calcular mediante la ecuación de Grynkiewicz12. Dado que la señal de fluorescencia se obtiene de la excitación del tinte en dos longitudes de onda (340 nm y 380 nm), la relación de las señales de fluorescencia corrige factores experimentales como la carga del tinte, la fuga de tinte, el fotoblanqueo y las densidades celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
La señalización de calcio es fundamental para la degranulación de mastocitos y se ha utilizado ampliamente en el estudio de las interacciones receptor-ligando, la identificación de ligandos y el descubrimiento de fármacos14. MRGPRX2 es un receptor de mastocitos recientemente descubierto que se ha encontrado que desempeña un papel clave en muchas enfermedades inflamatorias como la picazón, el asma y la dermatitis atópica, entre otras2. Además, se ha demostrado que v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SR y LDU desean reconocer el Proyecto de Investigación Estratégica Alberta Innovates, NRC y la subvención NSERC-Discovery para este proyecto.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
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