Peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células HEK projetadas
Summary
São descritas técnicas para a geração de uma biblioteca de peptídeos curtos que podem ativar células de mastro através do receptor MRGPRX2. As técnicas associadas são fáceis, baratas e podem ser estendidas a outros receptores celulares.
Abstract
Identificar ligantes específicos para receptores celulares terapeuticamente significativos é crucial para muitas aplicações, incluindo o projeto e o desenvolvimento de novas terapêuticas. O receptor de proteína G-X2 (MRGPRX2) é um receptor importante que regula a ativação de células de mastro e, portanto, direciona a resposta imune geral. Numerosos ligantes para MRGPRX2 foram identificados e incluem peptídeos endógenos como PAMPs, defensinas, LL-37 e outros fragmentos de proteína (ou seja, albumina degradada). A identificação adicional de ligantes específicos MRGPRX2 requer a triagem de um grande número de peptídeos (ou seja, biblioteca de peptídeos); no entanto, as células de mastro são difíceis e caras de manter in vitro e, portanto, não são econômicas de usar para triagem de grandes números de moléculas. O presente artigo demonstra um método para projetar, desenvolver e selecionar uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos usando mrGPRX2 expressando células HEK. Esta linha celular é relativamente fácil e barata de manter e pode ser usada para análise in vitro de alto rendimento. Um corante fluorescente Fura-2 sensível ao cálcio para marcar o fluxo de cálcio intracelular após a ativação foi usado para monitorar a ativação. A razão de intensidade de fluorescência de Fura-2 a 510 nm contra comprimentos de onda de excitação de 340 e 380 nm foi usada para calcular a concentração de cálcio. A biblioteca de peptídeos utilizada para verificar este sistema foi baseada no endogeno proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12), que é conhecido por ligar MRGPRX2 com alta especificidade e afinidade. Peptídeos subsequentes foram gerados através de truncação de aminoácidos e técnicas de escaneamento de alanina aplicadas ao PAMP-12. O método descrito aqui é simples e barato, mas robusto para a triagem de uma grande biblioteca de compostos para identificar domínios de ligação e outros parâmetros importantes que desempenham um papel importante na ativação do receptor.
Introduction
As células de mastro são parte integrante do sistema imunológico e desempenham um papel crucial nas respostas imunes inatas e adaptativas. As células de mastro são ativadas principalmente pela ligação de um antígeno à imunoglobulina E (IgE) – Complexo receptor fcεRI, ou pelo receptor de proteína G recentemente descoberto- X2 (MRGPRX2)1. A ativação mrGPRX2 tem sido associada a diversas doenças imunológicas e inflamatórias e, portanto, é importante compreender o mecanismo de ligação do receptor aos seus ligantes2. Para isso, uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos foi desenvolvida e rastreada contra receptores MRGPRX2 que foram superexpressos em células HEK. No estudo, a biblioteca de peptídeos foi construída utilizando-se técnicas simples e versáteis de escaneamento de alanina e truncação de aminoácidos. A varredura alanina envolve a substituição de aminoácidos específicos por um resíduo de alanina. Alanina sendo pequena e neutra, tira o peptídeo das propriedades específicas conferidas pelo resíduo substituído e destaca consecutivamente a significância das respectivas propriedades fisioquímicas do aminoácido nas interações receptoras. Pelo contrário, na truncação de aminoácidos, são projetadas sequências de peptídeos de tal forma que faltam um ou mais resíduos de aminoácidos do terminal N, terminal C, ou ambos. Este conjunto de peptídeos foi utilizado para identificar as sequências de aminoácidos cruciais para a ligação MRGPRX2.
A experiência com linhas de células de mastro humanos (LAD-2) mostrou que essas células são difíceis de cultivar e manter in vitro: um tempo de duplicação de duas semanas, suplementos médios caros e atenção direta necessária durante a passagem3. Esses atributos tornam as células inadequadas para a triagem em larga escala de ligantes potenciais. Aqui, células HEK transfectadas com estalagem expressando receptor MRGPRX2 (HEK-X2) foram usadas para tela da biblioteca de peptídeos1. As células HEK-293 são amplamente utilizadas e estudadas para a expressão heteróloga dos receptores superficiais devido à sua alta eficiência de transfecção, taxa de duplicação mais rápida e a necessidade de suplementos médios não caros para serem cultivados em laboratório4. O protocolo para transfetar a linha celular HEK-293 foi demonstrado e está bem estabelecido5. As células HEK-293 expressando o receptor MRGPRX2 (passagem 13-19) foram ativadas com os peptídeos gerados através de N-truncation, C-truncation, N+C-truncation e alanina scaning1. As células HEK do tipo selvagem (HEK-WT) (passagem 16-21) foram utilizadas como controle. A liberação intracelular de cálcio após a ativação foi monitorada para estudar a ativação baseada em MRGPRX2.
A ativação celular pelo MRGPRX2 é seguida por uma mobilização citosolítica de cálcio. Esta liberação de cálcio intracelular regulada em células de mastro é regulada pela entrada de cálcio operada na loja (SOCE), coordenada pela molécula de interação estromal 1 (STIM1); e é central para a cascata de resposta imune6,7. Vários métodos têm sido utilizados para detectar concentração intracelular de cálcio, incluindo grampos de remendo e corantes fluorescentes8. De todas as técnicas disponíveis, corantes fluorométricos de cálcio em conjugação com várias técnicas de detecção estão sendo amplamente utilizados9. Dois tipos de corantes fluorométricos que ganharam interesses são: corantes de comprimento de onda único como Fluo-4, e corantes complexos de comprimento de onda duplos como Indo -1 e Fura-2. A vantagem que os corantes de comprimento de onda duplo trazem sobre corantes de comprimento de onda único é que os corantes ratiométricos corretos para erros experimentais como carregamento de corante, branqueamento de fotos e foco10,11.
Fura-2 acetoximethyl ester (Fura-2 AM) é uma célula permeada, corante verde-fluorescente cuja excitação muda para um comprimento de onda mais baixo sobre a ligação de cálcio. Experimentalmente, a Fura-2 está animada em 340 e 380 nm, enquanto a emissão é registrada em 510 nm. Após a ligação de cálcio, a intensidade fluorescente a 340 nm aumenta enquanto a de 380 nm diminui, como mostra a Figura 1. Os dados são representados como uma razão de intensidade de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a intensidade após excitação em 380 nm (F380) ou seja, F340/F380. A razão F340/F380 é proporcional ao cálcio intracelular, o valor pode ser calculado pela equação de Grynkiewicz12. Uma vez que o sinal de fluorescência é obtido a partir da excitação do corante em dois comprimentos de onda (340 nm e 380 nm), a razão dos sinais de fluorescência corrige para fatores experimentais como carregamento de corante, vazamento de corante, fotobleaching e densidades celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
A sinalização de cálcio é central para a degranulação de células de mastro e tem sido amplamente utilizada no estudo de interações receptor-ligantes, identificação de ligantes e descoberta de medicamentos14. MRGPRX2 é um receptor de células de mastro recentemente descoberto que tem sido encontrado para desempenhar um papel fundamental em muitas doenças inflamatórias como coceira, asma e dermatite atópica, entre outras2. Além disso, vários medicamentos apro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A SR e a LDU gostariam de reconhecer a concessão do Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC e NSERC-Discovery para este projeto.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
