使用工程 HEK 细胞筛选激活 MRGPRX2 的肽

Summary

介绍了通过 MRGPRX2 受体生成短肽库以激活桅杆细胞的技术。相关技术简单、便宜，可扩展到其他细胞受体。

Abstract

识别特定于具有治疗意义的细胞受体的配体对于许多应用至关重要，包括设计和开发新的治疗方法。与Mas相关的G蛋白受体-X2（MRGPRX2）是调节乳腺细胞活化的重要受体，因此指导一般免疫反应。已确定MGPRX2的众多配体，包括PAMP、防御素、LL-37和其他蛋白质片段（即降解白蛋白）等内源性肽。进一步鉴定MGPRX2特定配体需要筛选大量的肽（即肽库）;然而，桅杆细胞很难和昂贵的体 外 维持，因此，不经济地用于筛选大量的分子。本文演示了使用 MRGPRX2 表达 HEK 细胞设计、开发和筛选小肽分子库的方法。这种细胞系相对容易和便宜的维护，可用于 体外 高通量分析。一种对钙敏感的Fura-2荧光染料，用于监测活化后细胞内钙通量。Fura-2 的荧光强度在 510 nm 时与激发波长 340 和 380 nm 的比例用于计算钙浓度。用于验证该系统的肽库基于内源性前列腺素 N-终端 12 （PAMP-12） 秘密，已知该秘密库将 MRGPRX2 与高特异性和亲和力结合。随后的肽通过氨基酸截断和应用于PAMP-12的阿兰宁扫描技术产生。此处描述的方法简单且价格低廉，但坚固耐用，用于筛选大量化合物库，以识别在受体激活中发挥重要作用的结合域和其他重要参数。

Introduction

乳腺细胞是免疫系统不可分割的一部分，在先天和自适应免疫反应中起着至关重要的作用。乳腺细胞主要通过抗原与免疫球蛋白E（IgE）-FcéRI受体复合物结合，或者通过最近发现的与男性相关的G-蛋白受体X2（MRGPRX2）1激活。MRGPRX2激活与多种免疫和炎症性疾病有关，因此，了解受体与其配体²的结合机制非常重要。为此，开发并筛选了一个小型肽分子库，对在 HEK 细胞中过度表达的 MRGPRX2 受体进行筛选。在这项研究中，肽库是使用简单多才多艺的阿兰宁扫描和氨基酸截断技术构建的。阿兰宁扫描涉及用阿兰宁残留物取代特定的氨基酸。Alanine 是小而中性的，剥离了被替换残留物赋予的特定特性的肽，并连续突出了氨基酸在受体相互作用中各自的物理化学特性的重要性。相反，在氨基酸截断中，肽序列的设计使其缺少来自N终端、C终端或两者兼有的一个或多个氨基酸残留物。这组肽用于识别对 MRGPRX2 结合至关重要的氨基酸序列。

人类桅杆细胞系（LAD-2）的经验表明，这些细胞很难 在体外培养和维持：两周的加倍时间，昂贵的中等补充剂，以及通过³期间需要的直接注意。这些属性使细胞不适合大规模筛选潜在的配体。在这里，稳定地转染的 HEK 细胞表示 MRGPRX2 受体 （HEK-X2） 用于筛选肽库^1。HEK-293细胞由于其高转化效率、较快的翻倍率以及需要在实验室⁴中培养非昂贵的中等补充剂，被广泛用于表面受体的异质表达。转染 HEK-293 细胞线的方案已经得到证明，并且已经建立了^5。HEK-293细胞稳定地表达MRGPRX2受体（通道13-19）被激活与肽通过N截断，C-截断，N+C截断，和丙氨酸扫描¹产生。野生型 HEK 细胞 （HEK-WT） （通道 16-21） 用作控制。激活后监测细胞内钙释放，以研究基于MGPRX2的活化。

MRGPRX2 的细胞激活后，细胞溶胶钙动员。乳腺细胞中这种受调节的细胞内钙释放由存储操作的钙进入 （SOCE） 调节，由频闪相互作用分子 1 （STIM1） 协调：并且是免疫反应级联^6，7的核心。各种方法已用于检测细胞内钙浓度，包括贴片夹和荧光染料^8。在现有的所有技术中，氟钙染料与各种检测技术结合，正在被广泛使用^。获得兴趣的两种氟染料是：单波长染料（如 Fluo-4）和双波长比例染料（如印度 -1 和 Fura-2）。双波长比度染料带来单波长染料的优势在于，双波长比度染料纠正了染料加载、照片漂白和聚焦^10、11等实验错误。

Fura-2 乙酰酯（Fura-2 AM）是一种细胞渗透的绿色荧光染料，其激发在钙结合后会转移到较低的波长。实验中，Fura-2 的兴奋度为 340 和 380 nm，而排放记录为 510 nm。钙结合后，340纳米的荧光强度增加，而380纳米的荧光强度降低，如图 1所示。数据表示为 340 nm （F340） 激发后的荧光强度与 380 nm （F380） 即 F340/F380 激发后的荧光强度比率。F340/F380的比例是成正比的细胞内钙，其价值可以通过格林凯维奇方程¹²计算。由于荧光信号来自两波长（340 nm 和 380 nm）的染料激发，荧光信号的比例对染料加载、染料泄漏、光出血和细胞密度等实验因素进行了修正。

Protocol

1. 肽库的设计与开发 要根据已知的配体即 PAMP-1213来识别桅杆细胞 MRGPRX2 受体的配体，请按照以下步骤操作。 通过连续通过固相肽合成（SPPS）截断配体的N端氨基酸残留物，生成N截断肽库。 通过截断已知配体的 C 端氨基酸残留物，由 SPPS 连续截断 C 截断肽库。” 根据 1.1.1 和 1.1.2 的结果，分别通过截断 N 和 C 端所需的残留物，使用 SPPS ?…

Representative Results

表1包含通过末期氨基酸截断和丙氨酸扫描产生的肽序列。如表1所示，肽序列RKKWNKWALSR缺乏N终端苯丙氨酸（F）的母体PAMP-12，因此是N截断库中具有代表性的肽。同样，在FRKKWNKWALS中，PAMP-12 C终端血清已被移除，代表从PAMP-12衍生的C-截断肽库。在N+C截断肽库中，从N和C终端中去除氨基酸。从N终端截断4个氨基酸，从PAMP-12的C终端截断1个残留物，在WNKWALS中产生。从丙氨酸扫描中…

Discussion

钙信号是乳腺细胞脱粒的核心，已广泛应用于受体-配体相互作用、配体鉴定和药物发现^等研究。MRGPRX2是最近发现的乳腺细胞受体，被发现在许多炎症性疾病，如痒，哮喘，和特异性皮炎，除其他^2。此外，一些经批准的药物已被证明通过MRGPRX2受体¹⁵引起炎症反应。因此，研究配体-受体相互作用、识别新的配体并了解激活机制势在必行。这项研…

Materials

Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	5470
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 Well	Sigma Aldrich	CLS3603
Black Polystyrene Microplate	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	High Glucose
DMSO	Thermo Fischer	D12345	Sterile, biological grade
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Molecular devices	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
Glucose	Sigma Aldrich	D8270
HEPES buffer	Thermo Fischer	15630-080
Ionomycin	Sigma Aldrich	I9657
L Glutamine	Thermo Fischer	25030-081
Pen Strep	Thermo Fischer	15140122
Peptides	RS Syntehsis	Custom	≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	12636
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888
TritonX-100	DOW Chemical	166704